WWW.NET.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Интернет ресурсы
 

«А. Н. Зимницкий, С. А. Башкатов, В. Н.Уразбаев. ОГЛАВЛЕНИЕ 1. ВВЕДЕНИЕ.. 2. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА.. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.. 3.1 ...»

ТАНДЕМНЫЕ ПОВТОРЫ ДНК И КОНЦЕПЦИЯ МАТРИЧНОГО СИНТЕЗА

ПРОТЕОГЛИКАНОВ

А. Н. Зимницкий, С. А. Башкатов, В. Н.Уразбаев.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………

2. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА………………………………………………

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………….

3.1 Квантово-химические исследования…………………………….

3.2 Спектральный анализ и дот-гибридизация……………………..

3.3 Биосинтез гликанов в клетках печени крыс…………………….

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ…………………………………………….

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………..

Рецензенты: д.б.н., проф. Хуснутдинова Э.К.

д.м.н., проф. Шараев П.Н.

д.б.н., проф. Чемерис А.В.

УДК 557.1:577.33:575.113.32:577.123

ТАНДЕМНЫЕ ПОВТОРЫ ДНК И КОНЦЕПЦИЯ МАТРИЧНОГО СИНТЕЗА

ПРОТЕОГЛИКАНОВ

А. Н. Зимницкий*, С. А. Башкатов1, В. Н.Уразбаев2 Закрытое акционерное общество « Плазан», Москва,125040 Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук, Уфа, 450075 Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа, 450054

АННОТАЦИЯ

Впервые выдвинута концепция матричного синтеза полисахаридов с участием тандемных повторов ДНК. Квантово-химические расчеты показали, что между азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и карбоксильной группой уроновых кислот или гидроксиметильной группой гексоз могут образовываться водородные связи.

Энергия этих связей сопоставима с таковой в комплементарных парах ГЦ и TA. Величины энергии связей неравноценны: карбоксильная группа уроновых кислот образует более прочные водородные связи с пуринами и менее стабильные – с пиримидинами. Гидроксиметильная группа гексоз, наоборот, - более устойчивые водородные связи образует с пиримидинами, менее прочные – с пуринами. Квантово-химическое моделирование показало, что в комплементарных парах пурин - уроновая кислота и пиримидин- гексоза образуются водородные связи, которые формируют двойную цепь нуклеиновая кислота полисахарид. Спектрофотометрические исследования и дот-гибридизация выявили образование комплексов [амилоза - полипиримидины (поли дЦ)], и [полиурониды полипурины (поли дA)]. Также наблюдалось образование комплексов [геномная ДНК тимуса телят - гиалуроновая кислота]. В механизме взаимодействий НК-полисахарид значимую роль играют связи между пуринами и карбоксильной группой остатка гексуроновой кислоты, а так же между пиримидинами и гидроксиметильной группой остатка гексозы. Охарактеризован фракционный состав полисахаридов ядер, микросом и гомогената клеток печени крыс. С помощью 14С1-глюкозы, примененной в качестве предшественника синтеза, изучен анаболизм ГАГ. Показано, что синтез полисахаридных фрагментов ГАГ начинается в структурах, ассоциированных склеточным ядром, и завершаются в эндоплазматическом ретикулуме клетки.

Ключевые слова: полисахариды, НК, комплементарность, матричный синтез.

Принятые сокращения:

ГАГ – гликозаминогликаны ксил – ксилоза ГК – гиалуроновая кислота гек – гексоза

–  –  –

Современная геномика признает, что лишь незначительная часть генома (1-5%) кодирует информацию о первичной структуре белковых молекул, причем, чем выше стоит организм в эволюционной лестнице, тем ниже плотность генетической информации, в современном понимании этого термина на тысячу пар нуклеотидов (т.п.н). К примеру (табл. 1), у бактерий данный показатель составляет 1-1.7 т.п.н. на ген, а у человека – более 30 т.п.н. на ген [1].

Таблица 1. Сопоставление размера геномов и количества генов [Киселев Л.

Л., 2000]

–  –  –

Условно, геном можно разделить на три группы нуклеотидных последовательностей – уникальные, средние (часто повторяющиеся сегменты ДНК) и быстрые повторы (сателлитная ДНК). Это деление является исключительно условным и определяется, как способность фрагментированной и денатурированной ДНК в растворе найти комплементарные участки при реакции реассоциации. Тем не менее, это условное деление позволяет изучить дискретно функциональную роль отдельных частей генома.

Так, было показано, что уникальные последовательности ДНК, в основном, отвечают за кодирование первичной структуры белковых молекул. Число их в геноме определяется несколькими последовательностями. Часть информации о повторенных генетических системах (гены гистоновых белков, рРНК, тРНК) кодируется так называемыми «медленными» повторами ДНК.

Роль «быстрых» повторов и сателлитной ДНК, в основном, до сих пор является загадкой. Ее зачастую называют «эгоистической», «мусорной», то есть практически не несущей какой-либо ценной информации для организма. Вместе с тем, удивляет тот факт, что именно количество этих последовательностей ДНК возрастает у организмов с наиболее высокой организацией живой материи (например, у человека повторенные участки генома составляют более 95% всех последовательностей ДНК). Данные, накопившиеся в последние десятилетия по инвертированным повторам, регуляторным участкам генов, центромерным и теломерным сателлитным ДНК, интронам, мобильным генетическим системам не внесли ясность в понимание функциональной роли тандемных повторов генома, которые в количественном выражении составляют его основу.

Объяснение роли повторов как «разбавителей» генетической информации уже не соответствует современному уровню знаний, поскольку оно не решает задачи выявления функциональной роли данной части генома, и скорее, наоборот, является признаком не изученности феномена [2].

Ряд исследователей считает, что тандемные повторы играют пока не известную, но очень важную роль в процессе эволюционного совершенствовании организма. Так, повторы имеют видоспецифичность [3] и их количество исчисляется сотнями тысяч и миллионами в геноме (табл. 2). Простые тандемные повторы, такие как 5-ЦА, 5-ГА, 5-АТ, 5-ГЦ присутствуют практически во всех эукариотах, и их количество в геноме огромно [2] Таблица 2. Некоторые тандемные повторы, диспергированные в геномах различных эукариот [Сингер М., Берг П., 1998]

–  –  –

записаны как (Пир-Пир), (Пур-Пур), (Пур-Пир) многократно повторены, где Пир – это пиримидины (Т и Ц) а Пур – это пурины (А и Г). Таким образом, в геноме налицо присутствие больших участков монопуринов и/или монопиримидинов, а также тандемных повторов, в которых усредненный компонент состоит из пурин-пиримидиновых оснований, примерно в равном соотношении. Также не вызывает сомнения тот факт, что в процессе транскрипции с молекулы ДНК считывается гораздо больше информации в гяРНК, часть которой вырезается в процессе созревания молекул РНК. Причем, если у прокариот наблюдается практически прямой перенос информации от ДНК к м-РНК без процессинга, то у высших организмов ситуация аналогична повторам ДНК. Чем выше организм стоит в эволюционной лестнице, тем больше у него считывается в РНК не смысловой информации для полипептидных цепей [2].

Если ДНК определяет развитие организма в онто- и филогенезе, а ее состав в значительной части описывается как димерный полимер, возникает закономерный вопрос, существуют ли в клетке иной биополимер, кроме РНК с подобной структурой? Как мы знаем, белки на эту роль не подходят изначально, поскольку триплетный код полипептидов требует, как минимум, трех различных мономеров для их синтеза.

Существует только одна группа биополимеров с тандемной структурой, которая играет ключевую роль в функционировании высших организмов как многоклеточных образований: это - полисахариды.

Полисахариды представляют собой биополимеры, состоящие из связанных между собой моносахаридов. Вплоть до 1960-х годов считалось [4], что углеводы служат только источником энергии (в форме моносахаридов и таких запасных полисахаридов, как крахмал и гликоген) и структурным материалом (например, такие полисахариды, как целлюлоза у растений и хитин у насекомых). Интерес к углеводам сдерживался чрезвычайной сложностью их структуры. В отличие от мономеров нуклеиновых кислот (нуклеотидов) и белков (аминокислот), которые способны связываться между собой только одним определенным путем, моносахаридные единицы в олигосахаридах и полисахаридах могут соединяться между собой несколькими путями по множеству различных положений. Если из четырех различных нуклеотидов можно получить только 256 тетрануклеотидов, то из четырех различных моносахаридов возможно образование 35560 уникальных тетрасахаридов [4]. Соответственно, биологический полиморфизм у полисахаридов неизмеримо выше по сравнению с белками и нуклеиновыми кислотами.





Полисахариды традиционно делятся по своему составу на гомополисахариды (гомогликаны) и гетерополисахариды (гетерогликаны). Практически все их химические структуры представлены в виде димерного звена, повторенного многократно (рис. 1 и табл. 3). Самыми распространенными в природе гетерогликанами являются гликозаминогликаны (ГАГ).

–  –  –

гексозаминов соединены о-гликозидными связями. Выделяют три основных класса ГАГ – несульфатированную гиалуроновую кислоту (ГК), среднесульфатированные хондроитинсульфаты (ХС) и высокосульфатированые гепарансульфаты (ГС) [5].

Последние два класса ГАГ относятся к протеогликанам. ГАГ в составе протеогликанов выполняют в межклеточном матриксе и внутри самих клеток разнообразные жизненно важные функции [5].

Биосинтез ГК изучен на гемолитических стрептококках группы А [6-8]. Эти синтетические процессы протекают аналогично и у высших животных [9,10]. В работе Roseman S. et al. [11-13] показано, что D-глюкоза является предшественником глюкозамина и глюкуроновой кислоты, которые служат мономерами ГК.

Непосредственными предшественниками ГК являются уридиндифосфонуклеотиды глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, выступающие донорами углеводных остатков при синтезе этого гетерогликана [14-17]. Путем ультразвуковой дезинтеграции культуры микроорганизмов, синтезирующих ГК, была получена бесклеточная система, способная синтезировать ГК в присутствии УДФ-глюкуроновой кислоты, УДФглюкозамина и ионов Mg2+ [15]. При этом фермент, осуществляющий синтез ГК, седиментировал при 100 000 g. Аналогичный энзим описан Schiler S. et al. [18,19] в коже эмбриона крысы, а Altschuler C. [20] – в многочисленных тканях кур, грызунов и человека.

В тканях высших животных, синтезирующих ГК, так же, как и у микроорганизмов, нуклеотидные производные образуются в реакциях, катализируемых пирофосфорилазами [21]. Ацетилирование УДФ-глюкозы происходит с участием ацетилкоэнзима А.

Превращение глюкозы в глюкозамин происходит до ее соединения с уридиндифосфонуклеотидом.

Вместе с тем, по сведениям Слуцкого Л.И. [22], приведенным в конце 70-х годов прошлого века, пришедшихся на период наиболее интенсивного изучения биосинтеза гетерогликанов межклеточного матрикса высших животных, и, по современным данным, местонахождение фермента синтеза полисахаридных фрагментов ГАГ в интактной клетке ассоциировано с мембранными структурами. Приходится констатировать, что сегодня, попрежнему остается неясным механизм заключительного этапа биосинтеза собственно ГАГ: каким образом в отсутствие матрицы достигается строгое чередование в макромолекулярной цепи гликана остатков ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты.

Изучение биосинтеза сульфатированных ГАГ показало, что он протекает, в основном, аналогично синтезу несульфатированной ГК, и предшественником моносахаридных остатков так же, как и в случае ГК, является D-глюкоза. Однако в случае ХС необходимым этапом является эпимеризация глюкозамина в галактозамин, а дерматансульфата – глюкуроновой в идуроновую кислоту. В работах ряда авторов [23-25] показана эпимеризация уридиндифосфатмоносахаридов в присутствии НАДФ+H+ специфическими эпимеразами. White B.N. et al. [26] констатировали обратимость реакций эпимеризации на примере превращения галактозамина в глюкозамин в ходе синтеза ГАГ.

Нуклеотидпроизводные гексуроновых кислот и гексозаминов при синтезе гепарансульфатов и, в частности, гепарина образуют не только -гликозидные связи, характерные для ГК и ХС, но и -гликозидные связи, присущие гепарансульфатам [27].

По современным представлениям, на первом этапе синтеза протеогликанов происходит трансляция мРНК белкового кора, осуществляемая на рибосомах шероховатой эндоплазматической сети. Затем инициируется гликозилирование белкового кора: происходит синтез участка связи будущего гликозаминогликана с полипептидной цепью. Место прохождения данного процесса не установлено, известно лишь, что в эндоплазматический ретикулум белковый кор поступает уже с полисахаридным фрагментом [28-32]. Считается, что синтез цепей ГАГ является нематричным: он происходит путем последовательного добавления к растущей углеводной цепи моносахаридов от доноров - УДФ-сахаров - с помощью гликозилтрансфераз. Их субстратной специфичностью определяется последовательность моносахаридов.

Инициацию роста цепей ГАГ осуществляет ксилозилтрансфераза. Однако ксилозилированию подвергаются не все остатки серина белкового кора. Полагают, что на выбор участка присоединения цепи ГАГ влияет аминокислотная последовательность гликозилируемого района [28, 29, 33]. После присоединения к белку остатка ксилозы происходит наращивание углеводной цепи последовательно двумя остатками галактозы и остатком глюкуроновой кислоты с помощью галактозилтрансфераз I и II и глюкуронилтрансферазы I.

Новосинтезированный тетрасахарид служит акцептором в первой реакции синтеза ГАГ. Полимеризация цепей ГАГ осуществляется многократным поочередным действием двух, связанных с мембранным аппаратом Гольджи ферментов. В случае хондроитинсульфатов и дерматансульфатов - это Nацетилгалактозаминилтрансфераза и глюкуронилтрансфераза II. Полимеризацию гепарансульфатов и гепарина осуществляют N-ацетилглюкозаминилтрансфераза и глюкуронилтрансфраза [28, 29, 34,35]. Решающую роль в определении строения цепей ГАГ играет структура белкового кора [33].

Непосредственным материалом для синтеза ГАГ служат нуклеотидные производные (уридиндифосфонуклеотиды) моносахаридов, которые образуются в ходе реакций, катализируемых пирофосфорилазами. Глюкуроновая кислота образуется из УДФ-глюкозы в результате двухэтапного окисления атома углерода в 6-ом положении с трансформацией гидроксильной группы в карбоксильную. Для синтеза дерматансульфата УДФ-глюкуроновая кислота эпимеризуется в УДФ-идуроновую кислоту с участием специфической эпимеразы.

Таким образом, установлено, что при биосинтезе ГАГ под действием одного ферментного комплекса происходит элонгация цепи гетерогликана путем последовательного присоединения к ней моносахаридных звеньев. Обработка модельной системы, синтезирующей ГК, рибонуклеазами и дезоксирибонуклеазами не прерывала нарастания цепи. Это было интерпретировано как доказательство нематричности биосинтеза ГАГ. Однако, на наш взгляд, полученные результаты не являются доказательством нематричности синтеза, так как в указанных исследованиях не проводился сравнительный анализ качества полученных в модельной системе и природных гликанов. Не вызывает сомнения, что указанный ферментный комплекс даже в отсутствии матрицы способен собирать гетерогликановую цепочку в случайном порядке, подобно синтезу НК в системах in vitro.

Для того чтобы как-то снять противоречия между несомненной упорядоченностью структуры ГАГ [28, 29] и представлениями о нематричности их синтеза в последнее десятилетие многие исследователи пытались привязать упорядоченность структуры ГАГ к матричности синтеза белкового кора протеогликанов, то есть представить аминокислотную последовательность белкового кора в качестве прообраза матрицы для синтеза гликозаминогликанов. На этом пути были получены определенные результаты, которые, правда, носили, в основном, характер статистических взаимосвязей, а не причинно-следственных зависимостей. По-видимому, такая ситуация многих устроила, и на сегодняшний день концепция нематричного синтеза ГАГ, сопряженного с белковым кором, вошла в учебники. Однако она полностью рассыпается, если вспомнить о том, что гиалуроновая кислота, имеющая молекулярную массу до 10 млн. Да представляет собой индивидуальный гликозаминогликан, не имеющий белкового кора в отличие от хондроитин- и гепарансульфатов.

Современные представления процессов биосинтеза протеогликанов связаны с изучением роли внутриклеточных мембран. Общеизвестно, что протеогликаны клетки практически постоянно ассоциированы с мембранными структурами. Биосинтетические процессы формирования протеогликанов, их внутриклеточный транспорт к органеллам, а также вынос на поверхность клетки в межклеточный матрикс сопряжены с функционированием мембран. Процесс накопления ГАГ в лизосомах, последующее их расщепление до моносахаров также тесно связан с функцией мембранных структур.

Только на поздних стадиях распада в лизосомах, а так же в таких клеточных структурах, как ядро и гранулы тучных клеток детектируются свободные протеогликаны или ГАГ, не ассоциированные с мембранами.

Сегодня отсутствует информация, или она очень скудна, в отношении начальных этапов синтеза ГАГ, а также их транспортировки к месту формирования полисахаридных цепей.[32]. В отсутствии общей согласованности представлений о структуре белкового кора, остается не ясным, определяет ли вообще белковый кор процесс формирования протеогликанов. Первичная структура корового белка, содержащая потенциальный сайт серин-ксилозилирования, свидетельствует, что белковая молекула не является определяющим фактором в «узнавании» сайта ксилозилирования.

Действительно, изучение первичной структуры корового белка сайта ксилозилирования показало некоторую консервативность данного участка во многих ПГ. Было показано, что гликозилируемые районы кора в протеохондроитинсульфатах хряща человека, свиньи и быка имеют аминокислотную последовательность Лей-Про-Сер-Гли-Глу, а в протохондроитинсульфате из хряща акулы Гли-Глу-Сер-Гли-Асп [28]. Наличие остатка глицина по соседству с серином служит обязательным, и практически единственным доказанным требованием для гликозилирования остатка серина. К аналогичному выводу привели исследования нуклеотидов в кДНК гена белкового кора протеохондроитинсульфата из опухоли желточного мешка крысы. Оказалось, что акцептором в реакции гликозилирования является район кора, состоящий из 49 чередующихся остатков серина и глицина. Подобная закономерность была установлена и для других протеогликанов. В частности было показано для гликозилируемых районов протеогепарина кожи крыс, представленных серинглициновыми повторами, что каждые два из трех остатков серина гликозилированы. Дальнейшие исследования первичной структуры сайта гликозилирования коровых белков, каких либо значимых результатов не дали, поскольку они свидетельствовали об уникальности аминокислотной последовательности изученных структур [28].

Исходя из этого, представляется вероятным, что конформация мембранных структур, вероятно, является определяющим звеном в узнавании сайтов ксилозилирования белковых молекул протеогликанов. Это предположение имеет право на существование, поскольку основной детерминирующий фактор ксилозилирования, по-видимому, связан с мембранными структурами эндоплазматического ретикулума и аппаратом Гольджи, где активность гликозилтрансфераз детектируется в значительном количестве [32].

Синтез связующего тетрасахарида (к трисахариду добавляется остаток уроновой кислоты) определяет направление процесса биосинтеза соответствующей цепи гликозаминогликана за счет инициации присоединения определенного Nацетилгексозамина. Таким образом, формирующийся протеогликан поступает в соответствующий участок его синтеза, который содержит галактоза-N-ацетилтрансферазы или глюкоза-N-ацетилтрансферазы, что и определяет направленность синтеза полисахаридной цепи. Именно аминокислотная последовательность пептидной части молекулы определяет положение вновь синтезируемого протеогликана на мембранных структура и, таким образом, детерминирует направленность процесса синтеза и модификации полисахаридной цепи соответствующими ферментативными системами[32].

Первичная структура гликозаминогликанов в протеогликановой молекуле является важнейшим фактором, определяющим их функциональную роль. Так, размер цепи гликозаминогликанов, степень и локализация сульфогрупп, а так же их эпимеризация, являются очень важными факторами, определяющими свойства и биологическую роль протеогликанов. Степень модификации цепи полисахарида и ее протяженность, вероятно, зависят от структуры мембранносвязанных комплексов, осуществляющих синтез протеогликанов. Мембранные ферментативные комплексы играют ключевую роль в эпимеризации и /или сульфатировании полисахаридных цепей ГАГ [32].

Окончательное подтверждение невозможности переноса результатов экспериментов по биосинтезу гликозаминогликанов, полученных in vitro, на in vivo было представлено Lindahl U., Kjellen K в 1987 году [36]. Изучая биосинтез гепарина, эти исследователи показали, что полисахариды, полученные из интактных микросом, содержали протяженные последовательности и N-сульфатированных, и Nацетилированных дисахаридов, что указывало на неслучайный характер их синтеза.

Напротив, продукты, полученные солюбилизированной микросомной системой, демонстрировали случайное распределение таких групп с большей долей чередующихся N-ацетилированных и N-сульфатированных дисахаридов [36]. Эти данные, практически, констатировали факт генетической детерминации в системах in vivo синтеза гликозидной части молекулы протеогликанов, поскольку их первичная структура имеет ткане- и видоспецифичность.

Базовой единицей полисахаридов при формировании их мономеров, можно считать глюкозу, которая в растворе присутствует в - и -форме благодаря реакции мутаротации.

Также этот моносахарид может эпимеризоваться в другие гексозы и окислятся с образованием глюкуроновой кислоты и других гексуроновых кислот. Подобная лабильность глюкозы приводит к тому, что в биосинтетических системах всегда находится в достатке гексозы и гексуроновые кислоты в - и -форме. Эти моносахариды, содержащие уридиндифосфат при углероде в первом положении, служат основными компонентами в синтезе полисахаридных цепей.

Как видим (рис.1, табл. 3), основная масса известных структурных и резервных полисахаридов состоят из двух мономеров – гексозы и гексуроновой кислоты, имеющих о-гликозидные связи (1-3), (1-4) в альфа- или бета форме с различной степенью модификации по различным атомам углерода вследствие ацетилирования, аминирования, сульфатирования и пр. Тем не менее, все эти биополимеры можно объединить в одну группу с универсальной структурой (А-Б), (А-А) или (Б-Б), повторенной многократно, где А - это гексоза, а Б – гексуроновая кислота.

По нашему мнению, отмечается сходство в периодичности первичной структуры полисахаридов и тандемных повторов ДНК. Учитывая это сходство структур полисахаридов и тандемных повторов ДНК, представлялось важным и обоснованным исследовать вопрос возможной комплементарности между моносахарами гликанов и азотистыми основаниями нуклеиновых кислот с целью определения их возможной комплементарности.

Проверка концепции возможной комплементарности оснований нуклеиновых кислот гексозе и гексуроновой кислоте в нашей работе осуществлялась методами квантовой химии для частного случая таких моносахаридов, как глюкоза и глюкуроновая кислота в структуре гетерополисахарида гиалуроновой кислоты. Безусловно, данный метод носит расчетный характер и его выводы требуют экспериментального подтверждения, в связи с чем представлялось целесообразным получение эмпирической информации, подтверждающей или опровергающей результаты квантово-химических расчетов. С этой целью мы использовали УФ-спектрофотометрию и метод дотгибридизации, позволяющие детектировать образование специфических комплексов в биополимерах.

Поскольку остается не выясненным механизм инициации биосинтеза ГАГ, представлялось целесообразным изучение процесса синтеза гликанов в печени крыс на модели введения повышенных доз глюкозы. Учитывая неадекватность использования SO42- в качестве радиоактивной метки синтеза ГАГ, мы пришли к заключению о необходимости пометить предшественник синтеза самой полисахаридной цепи гликана.

Этим предшественником является глюкоза, из которой образуются сначала УДФ-глюкоза, а затем УДФ-глюкуроновая кислота, идущая на синтез ГАГ. Необходимо учитывать тот факт, что образующийся из глюкозо-6-фосфата рибозо-5-фосфат включается в состав нуклеиновых кислот. В пентозофосфатном цикле, как известно, остаток глюкозы, превращаясь в рибозу, теряет углерод в первом положении, который уходит в составе углекислого газа, поэтому для исключения образования радиоактивных НК в экспериментах мы применили 14С-глюкозу, меченную по С1. Для решения поставленной задачи был изучен фракционный состав полисахаридов печени крыс, включая ядра и микросомы клеток, а также гомогената печени. Кроме того, в ядерных и мокросомных фракциях была определена динамика накопления радиоактивных сахаров, которые являются предшественниками полисахаридов.

2. УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Квантово-химическое моделирование биологических объектов, в частности геометрического и электронного строения НК и полисахаридов, требует от используемых методов возможности адекватно воспроизводить эффекты слабых межмолекулярных взаимодействий, таких как водородные связи. Такой метод, как MP2, использующий базисы с диффузными и поляризационными функциями, довольно хорошо отвечает данному требованию [37, 38], но мало пригоден для исследования подобных систем из-за их размеров, требующих чрезмерно большого количества времени и вычислительных ресурсов. Альтернативой данной ситуации может служить использование соответствующих полуэмпирических методов. Ранние полуэмпирические методы (MINDO/3 и MNDO) сильно занижали энергию водородных связей, что делало их непригодными для исследования биополимеров [39]. Для устранения подобных недостатков были разработаны методы AM1 [40] и PM3 [41], основанные на приближении, в котором пренебрегается двухатомным дифференциальным перекрыванием (Neglect of Diatomic Differential Overlap – NDDO). Эти методы, по замыслу авторов, должны были успешно описывать системы с водородными связями. В случае AM1 это не совсем удалось: несмотря на то, что рассчитанные значения энергии водородных связей довольно хорошо совпадали с экспериментальными, геометрические параметры не соответствовали действительности [42]. При параметризации метода РМ3 было учтено значительно большее количество экспериментальных данных, чем при параметризации других полуэмпирических методов, что дало возможность методу РМ3 хорошо описывать геометрическое строение и теплоты образования молекул. Метод PM3 оказался первой действительно удачной попыткой приближения результатов полуэмпирических расчетов систем, содержащих водородные связи, с экспериментальными данными и результатами расчетов ab initio [43].

Метод аb initio – основной метод расчета в квантовой химии, состоящий в решении одноэлектронных уравнений Хартри-Фока. В качестве исходных данных здесь используются заряды ядер и их положение в молекуле, наборы базисных функций слейтеровского или гауссовского типов. Этот метод не использует ни одно из наблюдаемых физико-химических свойств веществ, поэтому имеет эквивалентное название – неэмпирический расчет. В расчетах ab initio чаще всего применяется приближение МО ЛКАО (молекулярные орбитали в виде линейной комбинации атомных орбиталей), принимающее в рассмотрение все электроны исследуемой системы. Это наиболее точный из вычислительных квантово-химических методов, особенно в среднем (6-31G*) и большом (6-31**) базисах, позволяет корректно рассчитывать электронное и геометрическое строение водородных связей, играющих важную роль в биологических объектах.

Теоретические расчеты в нашей работе выполнены неэмпирическим методом ab initio в базисе 6-31G* и полуэмпирическим методом PM3. Расчет геометрических параметров и энергетических характеристик взаимодействующих пар нуклеотидов и сахаридов проводился неэмпирическим и полуэмпирическим методами, а структур, содержащих несколько пар нуклеотидов и сахаридов, – полуэмпирическими. Все расчеты производились с полной оптимизацией геометрических параметров по программе GAMESS [44]. Поиск глобального минимума полной электронной энергии проводили по методу Newton-Raphson с градиентом энергии 0.010 ккал/моль из разных начальных приближений структуры комплекса.

Получение полиуронидов овса. Свежие 10 – 12-дневные проростки овса тщательно измельчали, затем подвергали гидролизу в 2М NaOH в соотношении 1:10 (вес:объем) в течение 1 суток при комнатной температуре при периодическом помешивании. После этого гидролизат нейтрализовали концентрированной HCL до pH 7.0. Полученный раствор фильтровали через бумажный фильтр. Далее методом гельфильтрации на сефадексе G 25 производилось обессоливание образца, очистка от низкомолекулярных примесей и получение высокомолекулярной фракции, содержащей полисахариды.

Собранный образец для получения полиуронидов фракционировали методом анионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе. Для этого образец вводили в колонку, заполненную уравновешенной дистиллированной водой волокнистой DEAEцеллюлозой в хлоридной форме. Колонку последовательно промывали дистиллированной водой, 0.15 М и 0.5 М растворами хлорида натрия до минимальных значений оптической плотности элюента при =220 нм. Затем 1.5 М NaCL элюировали полиурониды. Для освобождения от хлористого натрия собранную фракцию подвергали гельфильтрации на сефадексе G 25, контролируя присутствие хлоридов реакцией с азотнокислым серебром.

После этого фракцию сушили под вакуумом при 450С и получали глюкуроноксиланы в сухом виде чистотой не ниже 95%, доля гексуроновых кислот составляла не менее 95%.

Качество полученного продукта контролировали реакцией Дише на уроновые кислоты.

Для этого готовили образец раствора, содержащий полученный продукт в концентрации

0.1 мг/мл. После этого к 0.5 мл образца добавляли 3 мл концентрированной серной кислоты, содержащей 0.025 М тетраборнокислого натрия, тщательно перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 10 минут. После охлаждения до комнатной температуры к образцам добавляли по 0.1 мл 0,1% спиртового раствора карбазола и нагревали в течение 15 минут в кипящей водяной бане, после чего охлаждали и измеряли оптическую плотность против контроля при =530 нм. Концентрацию полиуронидов (мг/мл) находили по калибровочному графику, построенному по водным растворам глюкуроновой кислоты.

Получение глюкуроноксиланов чеснока. Нечищеные луковицы чеснока тщательно измельчали, затем подвергали гидролизу в 2М NaOH в соотношении 1:10 (вес:объем) в течение 1 суток при комнатной температуре при периодическом помешивании. После этого гидролизат нейтрализовали концентрированной HCL до pH 7.0. Полученный раствор фильтровали через бумажный фильтр. Далее методом гельфильтрации на сефадексе G 25 производилось обессоливание образца, очистка от низкомолекулярных примесей и получение высокомолекулярной фракции, содержащей полисахариды.

Собранный образец для получения глюкуроноксиланов фракционировали методом анионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе. Для этого образец вводили в колонку, заполненную уравновешенной дистиллированной водой волокнистой DEAEцеллюлозой в хлоридной форме. Колонку последовательно промывали дистиллированной водой, 0.15 М и 0.3 М растворами хлорида натрия до минимальных значений оптической плотности элюента при =220 нм. Затем 0.5 М NaCL элюировали глюкуроноксиланы. Для освобождения от хлористого натрия собранную фракцию подвергали гельфильтрации на сефадексе G 25, контролируя присутствие хлоридов реакцией с азотнокислым серебром.

После этого фракцию сушили под вакуумом при 450С и получали глюкуроноксиланы в сухом виде. Качество полученных продуктов контролировали реакцией Дише на уроновые кислоты, как описано выше. Чистота препарата была не ниже 95%, доля гексуроновых кислот составляла 20%.

Получение гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов, гепарансульфатов) из плаценты человека. Ткань плаценты тщательно измельчали, затем подвергали гидролизу в 2М NaOH в соотношении 1:10 (вес:объем) в течение 3 суток при комнатной температуре при периодическом помешивании. После этого гидролизат нейтрализовали концентрированной HCL до pH 7.0. Далее для осаждения не разрушенных белков медленно прибавляли концентрированный раствор трихлоруксусной (ТХУ) кислоты до конечной концентрации 5%. Образующийся осадок выдерживали 1 час при 40С, затем отделяли его центрифугированием при 1500 g в течение 10 минут.

Концентрированным раствором NaOH рН надосадочной жидкости доводили до 10-11, так как часть белков, не осажденных ТХУ, выпадает в осадок в щелочной среде. После формирования осадка проводили очередное центрифугирование (1500g, 10 минут), осадок отбрасывали. Полученный раствор фильтровали через бумажный фильтр. Далее методом гельфильтрации на сефадексе G 25 производилось обессоливание образца, очистка от низкомолекулярных примесей и получение высокомолекулярной фракции, содержащей гликозаминогликаны.

Собранные образцы для получения гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов фракционировали методом анионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе. Для этого каждый образец по отдельности вводили в колонку, заполненную уравновешенной дистиллированной водой волокнистой DEAE-целлюлозой в хлоридной форме. Колонку последовательно промывали дистиллированной водой и 0.15 М хлоридом натрия до минимальных значений оптической плотности элюента при =220 нм. Затем 0.25 М NaCL элюировали гиалуроновую кислоту, 0.7 М NaCL – хондроитинсульфаты, 1.5 М NaCL. Для освобождения от хлористого натрия каждую фракцию подвергали гельфильтрации на сефадексе G 25, контролируя присутствие хлоридов реакцией с азотнокислым серебром.

После этого собранные фракции сушили под вакуумом при 450С и получали гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфаты и гепарансульфаты в сухом виде чистотой не ниже 95%. Качество полученных продуктов контролировали реакцией Дише на уроновые кислоты как описано выше.

Получение нуклеиновых кислот и амилозы. Зонд одноцепочечной олиго дT(16) был получен от СИНТОЛ (Россия). ДНК чеснока получали из меристематических тканей корней проростков чеснока, ДНК человека – из тканей плаценты фенольно-детергентным способом по [45]. Чистоту и концентрацию препаратов ДНК контролировали по оптической плотности или по флуоресценции с красителем Hoechst 33258 с помощью ДНК-минифлуориметра (Hoefer Scientific Instruments, США). Фрагментированная двухцепочечная ДНК тимуса телят (мол. масса~1 x 106 Дa ), а так же одноцепочечные поли дA(350), поли дЦ(350), поли дГ-Ц(350) были получены от «Amersham Biosciences».

Амилоза была получена от «Serva Feinbiochemica GMBH».

Спектрофотометрические исследования. Рабочие растворы полинуклеотидов готовили непосредственно в кварцевой оптической кювете с длиной оптического пути 2мм. Для этого к раствору 0.3М NaCL в 0.002М Na-фосфатном буфере рН-6.8 добавляли небольшие (5-25 мкл) объемы исходного раствора соответствующего полинуклеотида таким образом, чтобы суммарный объем составлял 400 мкл. После регистрации спектров поглощения или кругового дихроизма раствора полинуклеотида формировали комплекс полинуклеотид-полисахарид. Для этого к 400 мкл раствора полинуклеотида в кварцевой кювете добавляли необходимое количество исходного раствора полисахарида при перемешивании, после чего регистрировали спектры поглощения или кругового дихроизма.

Отжиг смеси препарата двухцепочечной ДНК с соответствующим полисахаридом проводили в закрытой кварцевой кювете с длиной оптического пути 2мм. Кювету, содержащую ДНК и полисахарид в соответствующей пропорции, прогревали на кипящей водяной бане в течение 2 мин и сразу же охлаждали в ледяной воде (0о С) в течение 30 сек. После этого регистрировали спектры поглощения или кругового дихроизма.

Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра “Specord MСпектры кругового дихроизма (КД) комплексов регистрировали при помощи портативного дихрометра СКД-2 производства Института спектроскопии РАН, г. Троицк.

Спектры КД представляли в виде зависимости величины кругового дихроизма А = AL – AR от длины волны. [46] Радиоактивное мечение препаратов нуклеиновых кислот. Радиоактивное мечение препаратов нуклеиновых кислот осуществляли в системе in vitrо по 5'-концу, используя -[32P] АТФ и полинуклеотидкиназу фага Т4 [47]. Дефосфорилирование проводили в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCL (pH9,0), 10 мM MgCL2, 10 мM спермидин и 1 мМ ZnCL2 при 370С в течение 30 мин в присутствии 0,1 единиц фермента.

Щелочную фосфатазу удаляли двукратной фенольной обработкой. Затем препарат НК осаждали этанолом и центрифугировали в микроцентрифуге 5 мин при 12000 об/мин.

Осадок, отмытый от фенола 70%-ным этанолом, подсушивали и растворяли в требуемом объеме бидистиллированной воды. Затем добавляли киназный буфер (50 мМ трис-HCL (pH7.6), 10 мM MgCL2, 50 мM дитиотрейтол, 1 мM спермидин), 1 - 2 МБк -[32P] АТФ и 2 единицы полинуклеотидкиназы фага Т4. Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ и фермент удаляли фенольной обработкой. Затем препарат осаждали этанолом, а не включившуюся метку удаляли или переосаждением этанолом, или гель-фильтрацией на сефадексе G 25.

Дот-гибридизация. Гибридизацию фильтров (BA83 и BA85 Schleicher & Shuell, Германия) с иммобилизованной на них ДНК и полисахаридами (по 20 мкг на дот-точку), с радиоактивно мечеными зондами НК проводили при 37°C в течение 18 - 24ч в гибридизационном буфере, содержащем 5 х раствор Денхардта (0.02% бычьего сывороточного альбумина, 0.02% поливинилпирролидона, 0.02% фиколла), 0.1% SDS натрия [48]. ДНК пробы перед нанесением на фильтры денатурировали кипячением в течение 5 мин. Фильтры высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку РМ-В в течение 1-7 суток.

Определение нейтральных сахаров. Нейтральные сахара (моносахариды в составе белково-полисахаридных комплексов) определялись антроновым методом по [49, 50].

Для этого к исследуемому образцу объемом 0,5 мл добавляли 4 мл антронового реактива (20 мг антрона на 100 мл 80% серной кислоты) и нагревали в кипящей водяной бане в течение 5 минут. Затем охлаждали водой до комнатной температуры и фотометрировали при =630 нм. Контролем служил водный раствор, обработанный антроновым реактивом, как описано выше. Концентрацию нейтральных сахаров определяли по калибровочному графику, построенному по растворам галактозы.

Для изучения фракционного состава ГАГ у интактных половозрелых неинбредных белых крыс, голодавших в течение 24 часов, получали гомегенат печени и ядерную фракцию, в которых определяли содержание фракций гликанов: гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфатов и гепарансульфатов. Для этого образцы подвергали щелочному гидролизу с последующей обработкой дезоксирибонуклеазой, гельфильтрацией на сефадексе G 25 и ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе, как описано выше.

Профиль элюции полисахаридов получали в градиенте ионной силы NaCL от 0 до 1.5М.

ДНК в ядрах и гомогенате печени крыс определяли по [22].

В следующей серии экспериментов неинбредные белые крысы весом 190-210 г получали однократно 14С-глюкозу, меченную по первому положению, внутрибрюшинно в дозе 1 г/кг, радиоактивность которой составляла 4х108 Бк на животное. Забой крыс и фиксацию печени в жидком азоте производили через 15, 30, 60, 120 и 360 минут после введения глюкозы. Методом дифференциального центрифугирования получали ядерную и микросомальную фракции [51], в которых определяли радиоактивность. Таким же образом получали гомогенат ткани, из которого по вышеприведенной схеме выделяли фракции ГАГ и определяли их радиоактивность.

Данные подвергали статистической обработке с помощью пакета компьютерных программ STATISTICA 6.0 for WINDOWS. При обработке полученных данных рассчитывали средние значения, стандартные отклонения, применяли статистические критерии различий, корреляционный, регрессионный, дисперсионный и факторный анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Квантово-химические исследования Исследование электронного и геометрического строения водородных связей в комплементарных парах НК методом РМ3 В качестве контроля были рассчитаны комплексы, образующиеся при взаимодействии классических комплементарных пар АТ и ЦГ, из которых состоит ДНК.

При выборе расчетных моделей было показано, что замена дезоксирибозофосфатных остовов метильными группами не изменяет характеристики водородных связей, но значительно уменьшает время расчетов. Найдено, что метод РМ3 адекватно описывает геометрическое и электронное строение водородных связей в парах АТ и ГЦ. Обе взаимодействующие молекулы находятся приблизительно в одной плоскости.

В паре АТ азотистые основания соединены двумя водородными связями, одна из них образуется между амино- и кето-группами, другая – между атомами азота пурина и пиримидина соответственно, средняя длина их составляет около 1.8, суммарная энергия обеих связей -5.55 ккал/моль (рис. 2). В паре ЦГ имеется три водородные связи, две из них образуются между амино- и кето-группами соответствующих оснований, третья – между атомами азота. Средняя длина водородных связей также около 1.8 (рис.2), что близко к значениям длин связей, указанным в работе [2]. Суммарная энергия трех водородных связей -11.73 ккал/моль (рис.2). Таким образом, метод РМ3 может быть использован и при изучении других типов водородных связей с участием азотистых оснований.

–  –  –

Рис. 2. Образование водородных связей в комплементарных парах АТ и ЦГ. Квантовохимический расчет методом РМ3. Здесь и далее: атомы углерода показаны зеленым или черным цветом, кислорода – красным, азота – синим, водорода – серым.

Произведенные расчеты методом РМ3 пар нуклеотидов, которые не являются комплементарными, представлены в таблице 4.

Таблица 4. Энергии водородных связей при образовании всех возможных пар между нуклеотидами: тимин (Т), аденин (А), цитозин (Ц), гуанин (Г).

–  –  –

Как следует из таблицы 4, нуклеотид А теоретически способен образовать пары в следующих вариантах:

-2.71 ккал/моль (А), -5.55(Т), -6.07(Ц), -7.08(Г). Казалось бы, исходя из величины энергии, будет выбран Г, или хотя бы Ц, но в реальности выбирается Т. Рассмотрим подробнее результаты расчетов взаимодействия пар нуклеотидов А и А, Г

–  –  –

Г-А Е = -7.08 ккал/моль Рис. 3. Образование водородных связей в некомплементарных парах АА, ГА и ЦА.

Квантово-химический расчет методом РМ3.

Как видно из рисунка 3, формирование водородных связей между некомплементарными нуклеотидами возможно, но нуклеотиды в этом случае соединяются только таким образом, что в случае АА и ГА не будут выдержаны углы между взаимодействующими нуклеотидами (рис.4), а в случае ЦА – не будет выдержано необходимое расстояние между двумя нитями двойной цепи НК (рис. 4). Оно будет больше [2].

Рис. 4. Геометрическое строение водородных связей в комплементарных парах АТ и ЦГ.

Исходя из этого, можно констатировать:

1). Методом РМ3 найдено, что комплементарность при формировании пар АТ и ГЦ обусловлена не только энергией образования водородных связей.

2). Главным образом, комплементарность существует благодаря направленности связей взаимодействующих нуклеотидов и расстоянию между дезоксирибозными остатками в двойной цепи НК.

Исследование электронного и геометрического строения водородных связей в комплементарных парах НК неэмпирическим методом аb initio в базисе 6-31G* Повторные расчеты методом аb initio в базисе 6-31G* с полной оптимизацией геометрического строения представлены на рисунке 5.

Т-А Ц-Г Е = -11.78 ккал/моль Е = -25.39 ккал/моль Рис. 5. Образование водородных связей в комплементарных парах АТ и ЦГ. Квантовохимический расчет методом аb initio в базисе 6-31G*. Цифрами и знаками показаны заряды по Малликену на взаимодействующих атомах водородных связей.

Метод аb initio в базисе 6-31G* также демонстрирует образование соответствующих водородных связей в комплементарных парах. При этом энергии связей примерно в 2 раза больше, чем при расчете методом РМ3, и длины водородных связей также больше примерно на 0.2, но порядок их изменения остается прежним. Анализ электронной плотности по Малликену [52] показывает, что на атомах водорода заряд связей положительный, около +0.5е, в то время как на взаимодействующих с ним атомах О и N заряд отрицательный, от –0.68 до –0.83е. Эти результаты также свидетельствуют об образовании достаточно устойчивых водородных связей.

Далее нами был произведен расчет методом ab initio не комплиментарных пар, а именно аденина с остальными нуклеотидами (табл. 5).

Таблица 5. Энергии водородных связей при образовании всех возможных пар между нуклеотидом А и Т, А, Ц, Г (ккал/моль)

–  –  –

Таблица 5 демонстрирует, что по электронной энергии для нуклеотида А выбор комплементарной пары Т не является наиболее энергетически выгодным. Выгоднее взаимодействия АЦ и АГ. Селективность присоединения нуклеотида достигается за счет особого геометрического строения двойной цепи НК (рис.4) [2]. Следовательно, методом аb initio в базисе 6-31G* нам удалось подтвердить, что комплементарность при образовании пар АТ и ГЦ связана не столько с энергией образования водородной связи, сколько с направленностью связей взаимодействующих нуклеотидов и расстоянием между дезоксирибозными остатками в двойной спирали НК.

Исследование электронного и геометрического строения водородных связей в комплементарных парах двойной цепи НК методом РМ3 Построим двойную спираль НК на примере 6 пар нуклеотидов Ц-Г, А-Т, Т-А, Г-Ц, Ц-Г, А-Т и произведем полную оптимизацию их электронного строения методом РМ3.

Полученные результаты показывают (рис.6), что формируемая спираль правого вращения с 12 парами оснований на виток, что характерно для Z-формы ДНК, состоящей из повторов пурин-пиримидиновых оснований. Эти данные согласуются с результатами эксперимента [2,53]. Длины водородных связей в двойной спирали ДНК соответствуют найденным при расчетах изолированных пар нуклеотидов с отличием до 0.02.

Энергия водородных связей составляет Е = -8.82 ккал/моль в пересчете на одну пару нуклеотидов, что составляет приблизительно среднему между энергиями связи в отдельных парах нуклеотидов:

-5.55 и – 11.73 ккал/моль. Таким образом, результаты расчетов позволяют предположить, что в двойных спиралях ДНК присутствует лишь исследованное нами взаимодействие между парами нуклеотидов, и других значимых взаимодействий нет.

–  –  –

Рис. 6. Образование водородных связей в комплементарных парах АТ и ЦГ двойной спирали ДНК на примере 6 пар нуклеотидов. Квантово-химический расчет методом РМ3.

Расчет «неправильных» пар нуклеотидов в составе двойной спирали НК, дал следующую картину: если взаимодействуют 2 пиримидина (T и Ц), то энергия их взаимодействия равна нулю, так как расстояние между ними слишком велико. При взаимодействии только пуринов (А и Г) нуклеотидам слишком «тесно», их кольца вынуждены изгибаться, а сахарофосфатные остовы – раздвигаться, что энергетически не выгодно, проигрыш в электронной энергии около 120 ккал/моль. Невыгодно и взаимодействие Т с Г и А с Ц – нарушается параллельность нуклеотидов.

Таким образом, квантово-химические расчеты показали:

1) В комплементарных парах АТ и ГЦ образуются водородные связи, но селективность при синтезе НК достигается не за счет разной величины энергий водородных связей.

2) Селективность достигается за счет геометрического строения двойной спирали НК, которая позволяет реагировать лишь тем парам, которые подходят по геометрическим параметрам (АТ и ГЦ). Все прочие взаимодействия энергетически невыгодны.

Следующим этапом работы было непосредственное исследование возможности образования комплексов между азотистыми основаниями НК и карбоксильной или гидроксиметильной группой полисахаридов. Вопрос исследования ставится следующим образом: «Могут ли образоваться водородные связи между основаниями НК и сахаридами, а также каким образом четыре вида азотистых оснований НК и структурные единицы полисахаридов (УДФ-глюкоза и УДФ-глюкуроновая кислота) взаимодействуют друг с другом?». Кроме того, представлялся важным вопрос, как может быть достигнута селективность при матричном синтезе полисахарида, например, гиалуроновой кислоты на молекуле НК?

Квантово-химическое исследование электронного и геометрического строения водородных связей в комплементарных парах НК и полисахаридов методом РМ3 Вначале был проведен выбор модели для расчетов. Нами установлено, что замена УДФ-глюкуроновой кислоты на глюкуроновую кислоту не изменяет характеристики водородных связей, но значительно уменьшает время расчетов, поэтому дальнейшие расчеты были проведены без фрагмента УДФ, связанного с сахаридом.

Предположим, что взаимодействие с НК происходит по карбоксильной или гидроксиметильной группе, соединенной с С5 атомом моносахаридного звена. Полная оптимизация геометрического строения комплексов, образующихся из различных начальных взаимных положений азотистого основания НК и глюкуроновой кислоты, приводит к нескольким локальным минимумам потенциальной энергии. Из них для каждой пары глюкуроновой кислоты и основания НК были выбраны структуры комплексов с наибольшей энергией взаимодействия между этими фрагментами (рис.7).

–  –  –

Рис. 7. Образование водородных связей между карбоксильной группой глюкуроновой кислоты и азотистыми основаниями ДНК. Квантово-химический расчет методом РМЗ.

Из строения комплексов четко видно, что, как и в случае взаимодействия Т с А, образуются две водородные связи, которые располагаются приблизительно в одной плоскости. Наиболее важным в этой ситуации представляется то, что эти связи имеют приблизительно такие же расстояния и энергии связывания, как и в комплементарных парах АТ и ГЦ. Кроме того, из рисунка 7 следует, что взаимодействие карбоксильной группы с нуклеотидами неравноценно. Лучше взаимодействуют нуклеотиды Г и А, хуже Т и Ц. Это происходит по причинам геометрического строения образующихся водородных связей. Водородная связь должна иметь определенную длину и направленность относительно других атомов, и в одних случаях условия образования водородной связи лучше, в других – хуже.

Далее были проведены расчеты РМ3 возможности взаимодействия нуклеотидов с гидроксиметильной группой N-ацетилглюкозамина. В каждом из четырех случаев было проанализировано множество начальных положений нуклеотидов и Nацетилглюкозамина. Оптимизация этих начальных положений привела к различным способам связывания нуклеотидов и N-ацетилглюкозамина. Из них были отобраны только максимальные энергии взаимодействия. Результаты расчетов приведены на рисунке 8.

Т - N-ацетилглюкозамин Ц - N-ацетилглюкозамин

–  –  –

Рис. 8. Образование водородных связей между гидроксиметильной группой Nацетилглюкозамина и азотистыми основаниями ДНК. Квантово-химический расчет методом РМ3.

Рассмотрим особенности образования водородных связей между нуклеотидами и гидроксиметильной группой N-ацетилглюкозамина. Известно, что гидроксиметильная группа образует менее устойчивые водородные связи по сравнению с карбоксильной группой [54]. Действительно, полная оптимизация геометрического строения комплексов, образующихся из азотистого основания НК и гидроксиметильной группы Nацетилглюкозамина, приводит соответственно к меньшим значениям энергии водородных связей (рис.8), по сравнению с комплексами, образующимися карбоксиметильной группой (рис.7). Результатом оптимизации геометрического строения комплексов нуклеотидов и N-ацетилглюкозамина из различных начальных положений взаимодействующих групп могут быть соединения, содержащие одну или две водородные связи. Однако наиболее энергетически выгодными, согласно расчетам методом РМ3, оказались комплексы, содержащие только одну водородную связь. Найдено, что энергии взаимодействия гидроксиметильной группы с нуклеотидами различны. Лучше взаимодействуют нуклеотиды Т и Ц, хуже Г и А.

Таким образом:

1) Квантово-химические расчеты показали, что между азотистыми основаниями НК и карбоксильной или гидроксиметильной группами сахаридов могут образовываться водородные связи, энергия которых сравнима с таковой в комплементарных парах АТ и ГЦ.

2) Величины этих связей неравноценны: карбоксильная группа образует более прочные водородные связи с пуринами, менее прочные – с пиримидинами. Гидроксиметильная группа, наоборот, - более устойчивые водородные связи образует с пиримидинами, менее прочные – с пуринами.

3) Найденные разницы величин значений водородных связей не могут служить достаточным критерием для отбора необходимых структур моносахаридов.

Квантово-химическое исследование электронного и геометрического строения водородных связей в комплементарных парах НК и полисахаридов методом аb

–  –  –

Проведем оптимизацию геометрического строения комплексов, полученных в предыдущем разделе методом аb initio в базисе 6-31G*. (табл.6).

Таблица 6. Энергии водородных связей при образовании всех возможных пар между нуклеотидами Т, А, Ц, Г и карбоксильной группой глюкуроновой кислоты

–  –  –

предыдущем разделе: взаимодействие между карбоксильной группой глюкуроновой кислоты и нуклеотидами существует, его энергии достаточно, чтобы образовывать водородные связи типа тех, что присутствуют в классических комплементарных парах

ДНК. Однако порядок изменения величины энергии взаимодействия несколько иной:

более выгодно взаимодействие карбоксильной группы глюкуроновой кислоты с Ц и Г, менее выгодно – с Т и А (табл. 6). Результаты по взаимодействию гидроксиметильной группы N-ацетилглюкозамина с азотистыми основаниями, аналогичные полученным методом РМ3, получить не удалось. Если в начальном расположении 2 фрагмента связаны только по одной водородной связи, как для взаимодействия карбоксиметильной группы и атома водорода азотистого основания (рис.8), то в процессе оптимизации они поворачивались друг относительно друга таким образом, что задействованными оказывались такие атомы моносахаридного кольца, которые никак не могут быть связаны с нуклеотидом. По-видимому, это обусловлено тем, что величины энергий водородных связей по методу аb initio получаются большими, чем по методу РМ3, что приводит к ситуации, когда энергии взаимодействия отдаленно расположенных атомов Н и О, N также больше, и в процессе оптимизации эти отдаленно расположенные атомы сближаются с образованием новых водородных связей, которые не могут быть реализованы в условиях двойной спирали.

Таким образом, расчеты методом аb initio в базисе 6-31G* подтвердили, что между карбоксильной группой глюкуроновой кислоты и азотистыми основаниями Т, А, Г, Ц образуются по 2 водородные связи типа тех, что образуются в комплементарных парах АТ и ГЦ.

Электронное и геометрическое строение водородных связей в комплементарных парах двойной цепи НК-гиалуроновая кислота, полученное методом РМ3.

Селективность при матричном синтезе полисахаридов Рассмотрим возможность синтеза полисахарида на одноцепочечной молекуле НК.

Понятно, что даже если и могут формироваться отдельные водородные связи между азотистыми основаниями и моносахаридами, это не означает, что они будут образовываться и в условиях построения двойной цепи полисахарид - НК, поскольку возможны геометрические ограничения.

Построим два олигомера по 5 мономерных единиц: НК (ГЦГЦА) и олигосахарид (фрагмент гиалуроновой кислоты). Для НК возьмем цепь, рассчитанную нами ранее (рис.6). Построим также цепочку из 5 моносахаридов для гиалуроновой кислоты. Путем поворота моносахаридов по связям между ними выстроим полисахаридную цепочку таким образом, чтобы карбоксильные и гидроксиметильные группы могли образовать водородные связи с нуклеотидами. Сблизим обе цепочки так, чтобы расстояние между группами было в пределах 1.5-2.5, согласно рисункам 9 и 10, Г и А – с карбоксильной группой (рис.9), Ц – с гидроксиметильной группой (рис.10). Проведем полную оптимизацию полученной двойной цепи методом РМ3. Как видим, энергия взаимодействия по водородным связям (-7.04 ккал/моль в пересчете на одну пару) такой конструкции (рис. 9 и 10) значительная, она почти соответствует энергии взаимодействия в классической двойной спирали ДНК, -8.82 ккал/моль (рис.6).

Е = -7.04 ккал/моль в пересчете на одну комплементарную пару Рис. 9. Образование водородных связей в комплементарных парах Г - глюкуроновая кислота, А- глюкуроновая кислота, Ц- N-ацетилглюкозамин двойной спирали ДНКполисахарид на примере 5 пар. Квантово-химический расчет методом РМ3.(Показана связь А – глюкуроновой кислоты).

Е = -7.04 ккал/моль в пересчете на одну комплементарную пару

Рис. 10. Образование водородных связей в комплементарных парах Г- глюкуроновая кислота, А- глюкуроновая кислота, Ц- N-ацетилглюкозамин двойной спирали ДНКполисахарид на примере 5 пар. Квантово-химический расчет методом РМ3.(Показана связь Ц- N-ацетилглюкозамина) Сопоставление связей глюкуроновая кислота-пурин в составе двойной спирали НКполисахарид, по сравнению с изолированными глюкуроновой кислотой и пуринами не выявило особых различий: длины двух водородных связей равны 1.79. Однако связывание пиримидин- N-ацетилглюкозамин выявило очень интересные отличия по сравнению с изолированными фрагментами. В этом случае, кроме выявленной ранее одной водородной связи 1.86 (рис.10), существуют еще 1 водородная связь, с атомом кислорода соседнего нуклеотида (1.84 ). Кроме того, существует еще одна слабая водородная связь (2.59 ), направленная уже в другую сторону. Таким образом, Nацетилглюкозамин также имеет 2 водородные связи при реакции с нуклеотидами в цепи НК, что обусловливает достаточную прочность и высокую селективность его связи с нуклеотидами в нативной молекуле НК. Были рассчитаны также «неправильные» порядки чередования полисахаридов. В этом варианте так же, как и случае с «неправильным»

чередованием азотистых оснований в двойной спирали НК, получались очень низкие энергии водородных связей, или формирование двойной цепи НК-полисахарид не происходило, поскольку связи были энергетически невыгодными. Следовательно:

1) Квантово-химическими расчетами показано, что в комплементарных парах пурин глюкуроновая кислота и пиримидин - N-ацетилглюкозамин образуются водородные связи, которые формируют двойную цепь НК-полисахарид.

2) Определяющую роль в отборе того или иного моносахарида в процессе возможного синтеза полисахаридов играют геометрические параметры взаимодействующих цепей НК и полисахарида. Обнаруженная разница величин водородных связей не может служить достаточным критерием для отбора необходимых структур моносахаридов.

3) Метод квантово-химического моделирования подтвердил комплементарность пуринов карбоксильной, а пиримидинов – гидроксиметильной группе УДФ-моносахаридов.

3.2. Спектральный анализ и дот-гибридизация В таблице 7 приведены результаты биохимического определения состава полисахаридов. Необходимо отметить, что все использованные полисахариды являются конечным продуктом модификации, то есть «зрелыми» гликанами. Практически не модифицированным гликанами можно считать полиурониды, состоящие, в основном, из остатков уроновой кислоты, и амилозу, в состав которой входят только остатки глюкозы.

В глюкуроноксиланах гидроксиметильная группа сахарида в С5 положении замещена на водород. ГК и ХС имеют в С2 положении остатка гексоз ацетоамидную группу, а у ХС водород при углероде в 6-ом положении замещен на сульфогруппу, что сообщает дополнительный частичный отрицательный заряд данной молекуле. (табл. 7.) Таблица 7. Характеристика состава полисахаридов, использованных в экспериментах

–  –  –

На рис.11. представлена электрофоретическая характеристика полисахаридов, использованных в эксперименте. Как видим, полисахариды характеризовались достаточно высокой степенью очистки, что являлось важным условиям проводимого исследования.

Рис. 12. А. Спектр поглощения поли дЦ в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая

2) полиуронида (ПУ), r = 2. (r – здесь и далее отношение звеньев полисахарида к молярной концентрации нуклеотидов.) Б. Спектры кругового дихроизма поли дЦ в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая

2) полиуронида (ПУ), r = 2.

В. Спектр поглощения поли дА в отсутствие ( кривая 1) и в присутствии (кривая 2) полиуронида (ПУ), r = 1.

Г. Спектры кругового дихроизма поли дА в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая

2) полиуронида (ПУ), r = 1.

Рис. 13. А. Спектры поглощения поли дА в отсутствие (кривая 1) и присутствии (кривая

2) амилозы (АМ), r = 2.

Б. Спектр поглощения поли(дC) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая 2,3) амилозы (АМ), r = 0,5 ( 1 ), r = 1 ( 2 ), r = 2 ( 3 ).

В. Спектры кругового дихроизма поли дЦ в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая

2) амилозы (АМ), r = 2.

Данные, приведенные на рисунках 12А и 12Б, а также на рисунке 13А, показывают, что при смешивании поли дЦ с полиуронидом овса и поли дА с амилозой спектры поглощения и кругового дихроизма (КД) практически не изменяются. Этот результат может свидетельствовать о том, что между этими полинуклеотидами и полисахарами не образуется достаточно прочного комплекса.

Данные рисунка 12В, а также рисунков 13Б и 13В показывают, что при смешении поли дА с полиуронидом овса, а также поли дЦ с амилозой наблюдается уменьшение амплитуд, как в полосах поглощения, так и КД этих соединений. Уменьшение интенсивности максимума спектра КД при одновременном уменьшении амплитуды полос поглощения (гипохромный эффект) могут наблюдаться в результате увеличения спиральности и угла закручивания между основаниями полинуклеотида [55], что свидетельствует об образовании комплекса одноцепочечный полинуклеотид – полисахарид. Следует отметить, что спектры поглощения в этом случае изменяются на 9Учитывая тот факт, что гиперхромный эффект двухцепочечной ДНК (поли дA-поли дT) в 0.3 М NaCL составляет 27-30% (рис 14 А,Б), что соответствует ранее полученным данным [56], то подобное изменение в нашем эксперименте составляет ~ 30-35 % от гиперхромного эффекта, соответствующего полному спариванию оснований.

Рис. 14. А. Спектры поглощения поли дА x поли дТ16 (кривая 1) и эквимолярной смеси поли дА и поли дТ16 (кривая 2), r =1.

Б. Спектры кругового дихроизма поли дА х поли дТ16 (кривая 1) и эквимолярной смеси поли дА и поли дТ16 (кривая 2), r = 1.

Рис. 15. А. Спектры поглощения ДНК тимуса телят в отсутствие (кривая 1 до отжига, кривая 2 – после отжига) ГК, кривая 3 – ДНК тимуса телят в присутствии ГК после отжига. r = 1.

Б. Спектры поглощения ДНК тимуса телят в присутствии ХС до отжига (кривая 1) и после отжига (кривая 2), r = 1.

Данные, приведенные на рисунках 15А и 15Б, показывают, что хондроитинсульфат не образует прочного комплекса с молекулами ДНК, поскольку спектры поглощения ДНК в его присутствии после отжига практически полностью восстанавливаются. Иная картина наблюдается в варианте с гиалуроновой кислотой (рис.15А). Видно, что в этом случае наблюдается отчетливый гиперхромный эффект, равный ~ 10-11%. Этот факт может свидетельствовать об образовании комплекса между участками ДНК и гиалуроновой кислотой, которые являются препятствием для образования дуплекса ДНК в этих местах при охлаждении после отжига смеси ДНК - гиалуроновая кислота.

Результаты дот-гибридизации, представленные на рисунке 16 свидетельствуют, что ДНК из всех организмов специфически связывается с зондами олигодезоксинуклеотидов, причем, несмотря на полуколичественные оценки метода, можно констатировать, что тандемная последовательность Г-Ц находит большее количество комплементарных последовательностей в ДНК, нежели гомополимеры, состоящие из монопуринов и монопиримидинов (A и Ц). К примеру, ДНК человека содержит довольно много фрагментов поли дT и поли дГ-Ц, в то время, как последовательность поли дГ в геноме человека представлена меньшим количеством. Вместе с тем, ДНК чеснока характеризовалась несколько большим количеством именно поли дГ последовательностей, нежели ДНК человека. Эти данные вполне согласуются с современными представлениями о геноме растений [57].

Поскольку наша задача состояла в определении возможности образования специфических связей между нуклеиновыми кислотами и полисахаридами, данные по ДНК мы приводим здесь исключительно в качестве контрольных образцов.

–  –  –

Результаты авторадиографии (рис.16 и табл. 8) свидетельствуют о специфической гибридизации зонда поли дA с полиуронидами овса, причем уровень гибридизации соизмерим с таковым для молекул ДНК (ДНК чеснока), а зонд поли дЦ давал высокую специфическую гибридизацию с амилозой картофеля. Поскольку полиурониды овса практически полностью состоят из остатков гексуроновой кислоты, а амилоза картофеля представлена остатком гексозы, мы получили достаточно значимую специфическую гибридизацию пиримидинов (на примере Ц) с полигексозами, а пуринов (на примере А) с полиуроновыми кислотами.

Этот принцип сохраняется и в интерпретации данных по глюкуроноксиланам.

Известно, что данный полисахарид имеет одну карбоксильную группу примерно на четыре группы нейтральных сахаридов, то есть количество данных групп у глюкуроноксиланов примерно в три - четыре раза меньше, нежели у полиуронидов. И действительно, уровень образования связей с поли дA у глюкуроноксилана примерно в три раза ниже, чем у полиуронидов.

Правильный тандем поли дГ-Ц показал значимую гибридизации со всеми полисахаридами, в особенности с гликозаминогликанами. Однако самая высокая гибридизация данного тандема была обнаружена с гиалуроновой кислотой. Это согласуется с современными представлениями о тандемной структуре гиалуроновой кислоты, состоящей из димера остатков глюкозы - глюкуроновой кислоты, с которыми и образовал связи тандем пурин–пиримидинового зонда синтезированной нуклеиновой кислоты.

На рисунке 17 представлены результаты дот-гибридизации исследованных полисахаридов и ДНК из различных организмов с фрагментированной геномной ДНК тимуса телят. Как видим, максимальная радиоактивность отмечена в образце 9 при гибридизации геномной ДНК саму на себя. Тем не менее, повторенные фрагменты ДНК тимуса телят обнаружили гомологичные последовательности практически во всех геномных ДНК изученных организмах. Из полисахаридов только гиалуроновая кислота (4-тый ряд) нашла подобные себе структуры в геномной ДНК тимуса телят, образовав специфические комплексы по силе свечения радиоактивности, соизмеримые с комплексами ДНК-ДНК.

3.3. Биосинтез гликанов в клетках печени крыс Профиль элюции полисахаридов печени крыс и маркерных полисахаридов на DEAE-целюлозе в градиенте ионной силы NaCL приведен на рис. 18. В качестве маркеров нами использовались гомогликаны уроновых кислот (полиурониды овса) и глюкозы (амилоза картофеля).

–  –  –

0, 0, 1, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, Рис. 18. Профиль элюции полисахаридов печени крыс и полисахаридных маркеров на DEAE-целюлозе в градиенте ионной сила NaCL Как видим из профиля элюции, спектр полисахаридов печени крыс носит довольно сложный характер. Маркер гомогликана амилозы, состоящей из остатков глюкозы, показал отсутствие сахарида с подобной структурой нейтральных сахаров в гликанах клетках печени крыс, полученных по принятой нами методике (они остаются во фракции промывки колонки). Гомогликаны глюкозы снимаются с колонки 0.01М NaCL.Первый пик гликанов печени детектировался в ионной силе 0.02-0.03М NaCL. Далее до 0.15М NaCL детектировались полисахариды с большим отрицательным зарядом, нежели полисахариды нейтральных сахаров, но меньшим, чем фракция 0.25М NaCL, представленная, в основном, гиалуроновой кислотой, что является общеизвестным фактом [5]. Во фракции 0.7М NaCL и 1.5М NaCL мы получили практически классическое разделение ХС и ГС. Высоко заряженные полиурониды овса, как следовало ожидать, снимались с хроматографической колонки при максимальной ионной силе – около 1.2М NaCL.

Результаты количественного определения уроновых кислот, гексозаминов и НС в хроматографических фракциях представлены в таблице 9.

–  –  –

В 0.25М, 0.7М и 1.5М фракциях соотношение уроновые кислоты : гексозамины составляло примерно 1:1, что характерно для ГК, ХС и ГС и согласуется с литературными данными. Незначительное количество НС в 0.7М и 1.5М фракциях можно объяснить присутствием трисахаридного фрагмента, связывающего ГАГ с коровым белком в протеогликане.

Таблица 10. Содержание НС и уроновых кислот во фракции полисахаридов 0.15М NaCL ядер, микросом и гомогенате клеток печени интактных крыс (мкг:г ткани) (НС:УК)

–  –  –

0.15М фракция представляет собой гликаны, обогащенные нейтральными сахарами (табл. 9). Выделяются три составные части данной фракции: первый пик снимается ионной силой NaCL до 0.02М, второй – до 0.06М и третий, в виде плато, ионной силой до

0.15М. Описание первичной структуры полисахаридных фрагментов этой фракции представлено в таблицах 10 и 11. Как видим (табл. 11), ядерные олигосахариды имеют соотношение НС:уроновая кислота близкое 3:1, что свидетельствует в пользу присутствия здесь нейтральных трисахаридов, содержащих не более одного остатка уроновой кислоты.

В микросомах, как и в гомогенате, детектируются нейтральные олигосахариды, содержащие более одного остатка уроновой кислоты на трисахарид, причем количество уроновых кислот возрастает от 0.02М фракции до 0.15М в 6 раз.Эти результаты свидетельствуют, что присоединение уроновой кислоты к трисахариду осуществляется, в основном, в микросомах клетки. В ядрах идет присоединение только первого остатка уроновой кислоты к трисахариду.

Таблица 12. Содержание ДНК и гликозаминогликанов в ядерной фракции и гомогенате печени интактных крыс (мкг:г ткани)

–  –  –

Результаты количественного определения ДНК и состава ГАГ в ядерной фракции и гомогенате клеток печени представлены в таблице 12. Общее содержание ГАГ в ядерной фракции составило 6.12 мкг/г ткани, а в гомогенате – 102.81 мкг/г. Процентное содержание ГАГ в ядерной фракции было следующим: 0.15М – 23.20%, ГК – 23.86%, ХС

– 41.83%, ГС – 11.11%. В гомогенате аналогичные показатели составили: 0.15М – 40.87%, ГК – 23.09%, ХС – 22.95%, ГС – 13.08%.

Принятая нами методика выделения ядер позволяла получить около 5% этих клеточных структур в не разрушенной форме. Остальные ядра, вместе с их содержимым, были представлены в гомогенате тканей печени.

Для выявления связей между временем после введения глюкозы и изученными биохимическими показателями нами был проведен корреляционный анализ. В связи с тем, что эмпирическая выборка по своему объему относится к малым выборкам (n30), были рассчитаны параметрические коэффициенты эмпирической корреляции Пирсона и непараметрические коэффициенты ранговой корреляции Спирмена. Полученные результаты приведены в таблицах 13-15.

–  –  –

В таблице 13 выявлены сильные положительные корреляции между показателем времени и содержанием ГС в гомогенате (r=0.81), между уровнями ГС в ядре и фракцией

0.15Мг в гомогенате (r=0.95) и сильная отрицательная между содержанием фракции

–  –  –

В таблице 14 представлены 3 сильные корреляции: отрицательная между содержанием фракции 0.15Мя и ДНК в ядре, положительная между уровнем ГС в ядре и ХС в гомогенате, положительная между концентрацией фракции 0.15Мг и ХС в гомогенате (R=0.74).

Для выявления латентных переменных, объединяющих изученные показатели, нами был проведен факторный анализ (по программе «Варимакс»), результаты которого представлены в таблицах 15.

–  –  –

0.15Мг и ХСг. В Фактор2 включены показатели фракции 0.15Мя и ГКя. В Фактор3 вошли ДНКг и ГКг.

Наиболее важными результатами корреляционного анализа представляются выявленные сильные линейные связи между временем после введения глюкозы и содержанием ГС в гомогенате печени, а также между содержанием 0.15М фракции и ДНК в ядре. В первом случае мы констатируем увеличение времени синтеза самого модифицированного ГАГ (несет не менее двух сульфогрупп на дисахаридный фрагмент), подтверждаемое результатами факторного анализа, по данным которого время и содержание ГС в гомогенате входит в один фактор. Во втором случае мы, по-видимому, устанавливаем функциональную связь синтеза ядерных олигосахаридов фракции 0.15М с генетическим аппаратом клетки. Эти два биополимера относятся к двум совершенно разным классам, но в их биосинтезе используется один и тоже исходный компонент – глюкоза. Сильная отрицательная корреляция свидетельствует о конкуренции за исходный субстрат при биосинтезе данных веществ. В условиях нашего эксперимента, когда количество ДНК в ядрах клеток является величиной постоянной, отрицательная корреляция может свидетельствовать об усилении синтеза полисахаридов ядер фракции

0.15М при поступлении в клетку значительных доз свободной глюкозы, что

–  –  –

Рис. 19. Динамика накопления полисахаридов фракции 0.15М в ядре, нормированной по ДНК.

Исследования состава фракций 0.15М и ГАГ в ядрах, микросомах и гомогенате представлены на рис. 20. Как видно на указанном рисунке, ядерные ГАГ обогащены хондроитинсульфатами (около 42%), что согласуется с общепринятыми представлениями [32]. В гомогенате ГАГ представлены в основном гиалуроновой кислотой и ХС (около 23%), в микросомах все виды ГАГ представлены примерно в равном соотношении (около 12%). В отношении 0.15М фракции можно констатировать (табл. 11), что она, как мы указывали выше, представлена тремя основными компонентами. Результаты, представленные на рис. 21, свидетельствуют о высоком содержании этой фракции в микросомах (около 60%), в то время как в ядре их количество не превышает 23%. В гомогенате данный показатель был промежуточным по сравнению с ядрами и

–  –  –

Рис. 21. Процентное соотношение полисахаридов, содержащих различное количество нейтральных сахаров, в 0.15М фракции ядер, микросом и гомогенате клеток печени крыс.

Для изучения биосинтеза полисахаридных фрагментов, были проведены исследования динамики включения радиоактивно меченой глюкозы в состав цепи

–  –  –

Рис. 22. Динамика достижения максимума удельной радиоактивности полисахаридов, в зависимости от времени инкубации метки в животных. За 100% принят показатель максимальной радиоактивности фракции.

Максимум радиоактивности в образцах фракции 0.15М детектировалась в интервале 60-75 минут после введения глюкозы крысам, в то время как «зрелые» ГАГ (фракция 0.25-1.5М) обнаруживали максимум радиоактивности к 120 минутам эксперимента. Таким образом, инициация синтеза гликанов, видимо, связана с фракцией

0.15М, которая обогащена нейтральными олигосахаридами, что согласуется с общепризнанным представлением о биосинтезе протеогликанов.

Для выяснения вопроса, в каких субклеточных структурах инициируется образование полисахаридной цепи, нами была изучена динамика включения радиоактивно меченой глюкозы в ядерную и микросомальную фракцию печени крыс. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 23.

–  –  –

Рис. 23. Динамика накопления радиоактивной глюкозы в ядерной и микросомальной фракций печени крыс (сpm) в %. За 100% принят показатель суммы радиоактивности отдельных фракций по четырем временным точкам эксперимента.

Из графических зависимостей рисунка 23 следует, что в клеточных структурах метка детектируется после 30 минут эксперимента. Максимальное количество метки обнаружено уже к первому часу эксперимента в обеих фракциях. Необходимо отметить, что во фракции клеточных ядер скорость накопления метки к 1-му часу эксперимента была выше (ядра – 53%, микросомы - 44%). К 120 минутам эксперимента в микросомной фракции аккумулировано метки больше, чем в ядрах (микросомы -29%, ядра – 12%).

Затем, к трем часам эксперимента, метка вновь накапливалась интенсивнее в ядерных структурах (ядра - 33%, микросомы -26%).

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты свидетельствуют, что полисахариды имеют много сходств с нуклеиновыми кислотами. По-видимому, это во многом является следствием того, что нуклеиновую кислоту можно рассматривать как полимер рибоз или дезоксирибоз, имеющих заместители в виде азотистых оснований. Некоторые полисахариды способны образовать спиралевидные структуры самостоятельно, подобно НК (к примеру, гиалуроновая кислота, амилоза, целлюлоза).

Проведенные квантово-химические расчеты позволяют констатировать возможность селективного образования связей между УДФ-уроновыми кислотами и пуриновыми основаниями нуклеиновых кислот, а так же УДФ-гексозами и пиримидинами. Причем сила образования связей в цепи полисахарид - нуклеиновая кислота на мономер является очень близкой величиной к расчетному параметру, полученному для двойной спирали нуклеиновых кислот. Эта селективность позволяет нам предположить существование двоичного генетического кода НК-полисахарид, по вышеуказанному принципу, в дополнение к общепризнанному генетическому коду нуклеиновых кислот. Квантово-химические расчеты нашли подтверждение, как в экспериментах по дот-гибридизации, так и при спектральном анализе комплексов НКполисахарид.

Результаты спектрофотометричеких исследований показали, что амилоза селективно образует комплекс с полипиримидинами (поли дЦ), а полиурониды - с полипуринами (поли дA). Как известно, амилоза является гомогликаном гексозы, а полиурониды – гексуроновой кислоты. Отличие этих моносахаридов состоит в том, что глюкоза в положении С5 имеет гидроксиметильную группу, а у гексуроновой кислоты в С5 находится карбоксильная группа. В остальном эти моносахариды идентичны.

Учитывая данный факт, детектируемые различия по физико-химическим свойствам указанных полисахаридов можно интерпретировать в связи с различием их структуры по С5. Следовательно, результаты проведенных экспериментов могут свидетельствовать, что пурины (на примере А) способны избирательно образовать связи с карбоксильной группой остатка уроновой кислоты, а пиримидины – с гидроксиметильной группой остатка гексозы в составе полисахаридов. Эти экспериментальные данные согласуются с квантово-химическими расчетами, выполненными для цепи нуклеиновая кислотаполисахарид, что может служить подтверждением их корректности.

Формирование связей между нуклеотидами и гликанами было детектировано и при изучении взаимодействия «зрелых» гликозаминогликанов (гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата) с фрагментированной геномной ДНК тимуса телят. Первичная структура гиалуроновой кислоты характеризуется как многократно повторенный тандем остатка гексоз и уроновых кислот. В свою очередь, значительную массу ДНК высших организмов, в том числе и тимуса теленка, можно представить как многократно повторенный тандем пурин-пиримидиновых оснований [1,2]. Как следует из результатов экспериментальной части, гиалуроновая кислота животных находила в структуре ДНК тимуса телят комплементарные себе участки. Вместе с тем, хондроитинсульфат не проявил комплементарности в отношении ДНК тимуса телят, поскольку, как известно, в ХС, остаток гексозы при С6 несет сульфогруппу, что придает данной системе дополнительный частичный отрицательный заряд. Подобная модификация гексоз значительно изменяет физико-химические свойства полисахарида, что и может служить препятствием образованию водородных связей.

Дот-гибридизация также подтвердила возможную комплементарность гексоз пиримидиновым, а уроновой кислоты - пуриновым основаниями нуклеиновых кислот.

Причем уровень специфически образованных связей между НК и полисахаридами соизмерим со связями, формирующимися по принципам комплементарности в ДНК.

Таким образом, проведенное нами изучение взаимодействия полисахаридов с нуклеиновыми кислотами показало наличие комплементарности пуриновых оснований НК уроновым кислотам, а пиримидиновых оснований гексозам в полисахаридных цепях.

Дальнейшее исследование взаимосвязи генетического аппарата клетки с полисахаридами в рамках выявленного принципа комплементарности вероятно позволит с принципиально новых позиций оценить возможную генетически детерминированную микрогетерогенность полисахаридных фрагментов протеогликанов и увязать ее с пуринпиримидиновыми повторами ДНК. Хотя, безусловно, природа этих связей нуждается в дополнительных и всесторонних исследованиях.

Идея информативной емкости полисахаридных фрагментов протеогликанов не нова. Так, Зимина Н.П. и др. [28, 29, 58, 59] показали высокую химическую микрогетерогенность и нерегулярность структуры углеводных цепей молекул протеогликанов, сделав обоснованный вывод, что информативность молекул протеогликанов служит химической основой для выполнения ими сложных высоко специфических функций в жизни клетки. Метод секвенирования гликозаминогликанов не разработан, и о структуре их цепей имеются только косвенные данные, которые с учетом широкого распространения химической микрогетерогенности позволяют предположить, что цепи протеогликанов имеют нерегулярное строение с кластерным распределением дисахаридов. Так, для дерматансульфата кожи свиньи было доказано кластерное расположение связей, чувствительных к тестикулярной гиалуронидазе, а, следовательно, и остатку глюкуроновой кислоты. Обнаруженные кластеры располагались вдоль цепи нерегулярно, без какой-либо видимой закономерности [60]. Исследования структуры дерматансульфата слизистой оболочки кишечника и пуповины канатика свиньи также показали, что содержащие глюкуроновую кислоту дисахариды расположены в кластерах, которые распределены случайным образом вдоль цепи [60]. Кластерность распределения остатков различных уроновых кислот характерна для дерматансульфата шейки матки человека. Анализ картины профиля хроматографической элюции фрагментов дерматансульфата интимы аорты быка, полученных после обработки хондроитиназой АС, позволяют говорить о вероятной нерегулярности исходных цепей дерматансульфатов [61].

Исследование строения цепей гепарансульфатов и гепарина привело к заключению, что они имеют кластерную организацию. Показано, что в молекулах имеются протяженные районы, состоящие из дисахаридов с низкой степенью сульфатирования, основными компонентами которых является остатки глюкуроновой кислоты, а остатки глюкозы присутствует в небольших количествах [62]. Обнаружены и высоко сульфатированные кластеры, состоящие из сильно заряженных дисахаридов; их основными компонентами являются остатки глюкозы. Между этими районами, по-видимому, располагаются менее упорядоченные участки, в которых чередование сахаридов идет примерно в равном соотношении. Разные молекулы отличаются друг от друга протяженностью высоко- и низко заряженных районов.

Следует отметить, что в отличие от нуклеиновых кислот, у которых информационно значимой является строгая последовательность мономеров (нуклеотидов), у гликозаминогликанов информационно важным элементом служит структура олигосахаридных сайтов. Так, установлено, что способность протеогепарансульфатов и протеодерматансульфатов к самоассоциациии обусловлена существованием в цепи гликозаминогликанов особых протяженных районов – контактных зон с чередованием дисахаридов, содержащих остатки глюкуроновой кислоты и глюкозы с определенным расположением сульфогрупп [63]. Обращает на себя внимание факт существования детерминированной структурно-функциональной взаимозависимости у полисахаридных молекул, подобной той, какая наблюдается у нуклеиновых кислот [28].

Концепция нематричного синтеза полисахаридов, входящих в состав протеогликанов, не позволяла дать генетически обоснованного объяснения микрогетерогенности (полиморфизма) протеогликанов. Вместе с тем, постоянно пополняющиеся данные ясно свидетельствуют о большом разнообразии полисаридных фрагментов протеогликанов, причем этот полиморфизм имеет выраженную ткане-, органно- и видоспецифичность. Необходимо отметить, что современные представления о гликанах из-за их слабой изученности напоминают таковые о рибонуклеиновых кислотах на этапе становления молекулярной биологии. Класс веществ, вроде бы один, но первичная их структура совершенно отличается друг от друга. И если сегодня мы знаем, что каждая, к примеру, м-РНК является уникальным звеном в реализации генетической информации, то по отношению к гликанам, эти функции необходимо еще выяснить.

Проведенное исследование позволило охарактеризовать фракционный состав полисахаридов гомогената печени крыс. Как видно из рис.18, полисахариды печени крыс представлены сахаридами нейтральных сахаров, гексоз и гексуроновых кислот в разном соотношении и с различной степенью модификации мономеров (аминирование, сульфатирование, эпимеризация и т.п.).

Не вызывают сомнения результаты корреляционного анализа, установившие взаимосвязь между временем и синтезом самых модифицированных ГАГ – гепарансульфатов, поскольку известно, что их модификация связана с большей степенью сульфатирования, а значит более длительным по времени процессом созревания в сравнении с другими группами ГАГ.

Результаты корреляционного анализа (коэффициенты эмпирической корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спирмена) также показали наличие сильных линейных связей, существующих между структурами клеточного ядра (ДНК) и фракцией олигосахаридов ядер, снимаемых с хроматографической колонки DEAE-целлюлозы до

0.15М NaCL. Причем, подобных корреляций не обнаружено между показателями тотальной ДНК и фракцией олигосахаридов 0.15М гомогената (олигосахариды микросом, лизосом, ядер и иных клеточных структур, а также межклеточного матрикса). Указанная корреляционная зависимость свидетельствовала об усилении синтеза данной группы полисахаридов в ядре, при введении глюкозы, в особенности к концу первого часа эксперимента, что подтверждено и результатами количественного определения полисахаридов, нормированными по ДНК и представленными на рис. 19.

Фракция 0.15М олигосахаридов гомогената имела выраженную корреляционную связь с количественными показателями «зрелых» протеогликанов, как в гомогенате, так и в ядре.

Это может указывать на причастность данных олигосахаридов к процессу формирования «зрелых» ГАГ. Иными словами, усиление синтеза данной фракции полисахаридов в гомогенате приводило к увеличению биосинтеза протеогликанов (ХС и ГС). О том, что синтез протеогликанов начинается именно с этой фракции, свидетельствуют данные включения радиоактивной глюкозы в структуры ГАГ.

Необходимо отметить, что фракции олигосахаридов 0,15М не идентичны по составу в различных клеточных структурах. В ядре данная фракция представлена, в основном, компонентами нейтральных сахаров и уроновых кислот в отношении 3:0.75, что может свидетельствовать в пользу незавершенности процесса присоединения уроновой кислоты к нейтральному трисахаридному звену, который осуществляется в ядре. Фракция 0.15М олигосахаридов ядра в основном (на 83%) представлена компонентом, снимаемым в ионной силе 0.02М NaCL. Фракции 0.06 и 0.15М присутствуют в 11% и 6% соответственно. В микросомах удельный вес фракции 0.02М снижается до 55%, а 0.06М и

0.15М возрастают до 22% и 23% соответственно. В гомогенате наблюдается динамика, аналогичная микросомам, только фракция 0.15М представлена в более значимом количестве (до 32%).

Эти данные свидетельствуют о связи синтеза олигосахаридов, аналогичных по составу универсальному тетрасахариду протеогликанов, с ядерным аппаратом клетки, на что указывают и эксперименты с радиоактивной глюкозой, которые показали более высокие темпы накопления радиоактивности в ядерных структурах к концу первого часа эксперимента. Синтез олигосахаридов с формулой НС:УК в соотношении 3:1, скорее всего, осуществляется в ядре. Формирование же цепи гетерогликанов с тандемной структурой уроновая кислота-гексоза (1:1) идет в структурах микросомальной фракции.

Результаты изучения включения радиоактивной глюкозы во фракции ядер и микросом клетки (рис.23) показывают, что процесс накопления глюкозы на старте эксперимента (к концу первого часа) идет интенсивнее в ядерных структурах. Ко второму часу микросомы удерживают высокие показатели присутствия радиоактивной глюкозы, видимо, за счет оттока из ядра радиоактивных олигосахаров и формирования цепи ГАГ.

Результат трехчасовой инкубации метки в животных свидетельствовал об увеличении содержания радиоактивных сахаридов в структурах клеточного ядра, скорее всего, за счет поступления «зрелых» ГАГ из эндоплазматического ретикулума, что согласуется с современными представлениями о синтезе протеогликанов.

Представляется интересным обнаруженный нами факт первоочередной детекции радиоактивной метки гомогената в структуре полисахаридов фракции 0.15М NaCL (рис.22), а затем уже во фракции «зрелых» ГАГ (фракция 0,25М-1,5М). Изначально высокая радиоактивность этой фракции может быть обусловлена вхождением в ее состав гликанов, участвующих в инициации синтеза полисахаридной цепи ГАГ. Известно, что синтез ГАГ начинается с процесса ксилозилирования коровых белков и образования связующего тетрасахарида, затем формирование полисахарида осуществляется последовательным присоединением гексоз и уроновых кислот примерно в равном соотношении.

Сопоставляя результаты экспериментов по включению радиоактивной глюкозы в состав ГАГ и фракции клеточных структур, можно отметить, что высокие темпы накопления радиоактивности в ядре на старте соответствуют динамике включения метки в структуры полисахаридов фракций, снимаемых с хроматографической колонки ниже

0.15М NaCL (1-вый час эксперимента). Этого не происходит в случае «зрелых» ГАГ, максимум радиоактивности которых наблюдается только ко 2-му часу эксперимента. В указанный временной промежуток накопление метки в ядре минимально, а в микросомах оно более значимо. Таким образом, можно констатировать, что формирование цепи ГАГ в клетке связано с микросомами, а связующего тетрасахарида, регистрируемого в 0.15М фракции, - с ядерными структурами.

Указанная фракция полисахаридов (0.15М NaCL) не является ГАГ в классическом их представлении, поскольку не содержит характерное для ГАГ количество гексозаминов и, очевидно, представлена фрагментами связующих тетрасахаридов. Подчеркнем, что до тех пор, пока соотношение уроновая кислота - гексозамин в цепи не достигнет соотношения примерно равного 1:1 (что характерно для гиалуроновой кислоты), данные фрагменты из-за значительного присутствия нейтральных сахаров, будут сниматься с хроматографической колонки в меньшей ионной силе, чем ГК, то есть ниже 0.15М NaCL.

Поскольку синтез протеогликанов начинается с формирования связующего тететрасахарида, уровень радиоактивности этой фракции должен быть выше на старте эксперимента. Именно эти результаты и были получены нами.

Таким образом, представляется вероятным, что синтез гликозидной части протеогликанов в клетке носит ступенчатый характер: фрагменты ГАГ, представляющие собой связующий тетрасахарид, синтезируются в структурах, ассоциированных с клеточным ядром, на что указывают и результаты корреляционного анализа. Затем, они поступают в эндоплазматический ретикулум клетки, где после формирования основной цепи гликана и цикла биохимических модификаций из них формируются протеогликаны.

Синтез собственно цепи ГАГ осуществляется структурами ЭПР. Далее «зрелые» ГАГ частично поступают в ядро, но, в основном, экспортируются из ЭПР в межклеточное пространство для формирования межклеточного матрикса. Эти результаты согласуются с данными многих исследований, которые констатируют факт поступления в ЭПР и аппарат Гольджи корового белка уже с фрагментом связующего тетрасахарида (ксилоза-галактозагалактоза-уроновая кислота) [4, 28, 29, 32] и могут служить косвенным подтверждением выдвинутого нами предположения причастности ядерной ДНК к процессу синтеза универсального тетрасахарида протеогликанов.

С учетом полученных данных мы предлагаем концептуальный механизм реализации функциональной связи между ядерным аппаратом клетки и процессом формирования связующего тетрасахаридного звена белкового кора с гликозаминогликанами в протегликане.

Обобщая весь представленный экспериментальный материал, полученный с использованием различных методических подходов, предлагаем принять концепцию матричного синтеза протеогликанов с участием тандемных повторов ДНК.

Синтез протеогликанов, очевидно, начинается с транскрипции пре-м-РНК на молекуле ДНК. Формирование информационной части молекулы м-РНК корового белка осуществляется до кодона сериновой аминокислоты по общепринятым принципам. В случае, если после кодона серина следует триплетный кодон, комплементарный трисахариду уроновая кислота-гексоза –гексоза, то, по-видимому, наступают изменения в процессе транскрипции. Сначала отметим, что выдвинутым требованиям могут соответствовать в ДНК только восемь триплетных кодонов (АЦЦ, АЦТ, АТЦ, АТТ и ГЦЦ, ГЦТ, ГТЦ, ГТТ). Энергия связи при синтезе НК в данных триплетах распределена следующим образом: 1 триплет - около 11.7 ккал/моль (ГЦЦ), 3 триплета – около 9.6 ккал/моль ( ГЦТ, ГТЦ, АЦЦ), 3 триплета – около 7.6 ккал/моль (ГТТ, АЦТ, АТЦ) и 1 триплет – около 5.5 ккал/моль (АТТ). Как видим, в триплете АТТ энергия связи на мономер составляет всего около 5.5 ккал/моль, что ниже силы связи в триплетном дуплексе ДНК-полисахарид, величина которой составляет более 7 ккал/моль.

Такая ситуация в цепи синтеза РНК на молекуле ДНК при определенных обстоятельствах в случае кодона АТТ способна создать достаточно значимую конкуренцию со стороны УДФ-сахаров при формировании комплементарных пар, результатом чего может стать более выгодным, с энергетической точки зрения, процесс сборки трисахарида, нежели трех структурных единиц РНК. Таким образом, вероятен процесс, при котором уроновая кислота, образовавшая комплементарую связь с аденином ДНК, образует связь С5 с С2 рибозы последнего нуклеотида серинового кодона, одновременно трансформируясь в ксилозу, с реакцией декарбоксилирования в С6 положении углерода. Реакция декарбоксилирования может служить инициацией отделения сахаридного звена от молекулы ДНК. Далее образуется гликозидная связь между ксилозой и двумя гексозами (галактозами), которые образовали временные водородные связи с тандемом тимидина ДНК по общепринятой схеме.

Очевидно, in vivo в данных условиях часть синтезированной пре-м-РНК вместо триплетов рибонуклеиновой кислоты может иметь трисахариды ксилоза-галактозагалактоза в сайте формирования ветвления РНК на АТТ последовательности ДНК. Сам же триплет АТТ в смысловом значении, как известно, является «стоп-кодоном» синтеза полипептидной цепи (УАА), что также может являться косвенным доказательством выдвигаемого нами предположения. Если после данной последовательности следуют тандемные повторы ДНК (пурин-пиримидин, к примеру, цитидин-аденин), сила связи в которых при биосинтезе НК становиться около 8.8 ккал/моль, сборка олигосахаридов является невыгодной, и построение цепи идет по принципу комплементарности ДНКРНК, поскольку этот процесс вновь становится энергетически наиболее приемлемым. Мы допускаем, что хотя энергия связи в этой ситуации играет важную роль, сам же процесс может носить более сложный характер.

Таким образом, не исключена возможность присутствия в гя-РНК пре-м-РНК, несущей в себе трисахарид и следующий за ним участок тандемно повторяющихся рибонуклеотидов размером более 300 мономеров (что достаточно для формирования гликозидной части протеогликана), начинающихся с 5’-фосфат концевого гуанозина точки ветвления ядерных РНК. Вероятно, это может быть одним из объяснений способности указанных участков РНК блокировать работу обратных транскриптаз и их устойчивости к некоторым РНКазам. Именно гуанозин как пурин способен обеспечить в дальнейшем присоединение к трисахариду обязательного первого остатка уроновой кислоты, следующего за трисахаридом, одновременно являясь участком ветвления гя-РНК. В системе комплементарных связей РНК указанный трисахарид является аналогом последовательности УАА, а следующие за ним ГУ позволяют провести процессинг и сплайсинг интронной части пре-м-РНК по общепринятой схеме. Две галактозы способны образовать связи с двумя уридинами U-РНК процесингосом подобно аденину за счет гидроксиметильной группы. Таким образом, последовательность Гал-Гал-Г-У сохраняет способность функционировать как сайт связывания со структурами процессингосом, подобно конценсусной последовательности тетрануклеотида (ААГУ) сплайсинга.

Подобная цепь до конца серинового кодона представлена в РНК связью между сахаридами 3’-5’. Сахарид последнего нуклеотида серинового триплета по связи 2 взаимодействует с С5 ксилозы, что оставляет возможность ксилозе образовать связь по С1 положению с аминокислотой серин при инициации процесса ксилозилирования белкового кора. Затем ксилоза связью С4 соединяется с С1 димера галактозы. Последняя галактоза связью С2 взаимодействует с С5 сахаридом гуанозина. Таким образом, последний нуклеотид серинового триплета имеет свободную связь при С3, а последняя галактоза – свободную связь при С3, что в состоянии обеспечить формирования связи 3-1 с первым остатком глюкуроновой кислоты. Следующий за гуанозином уридин в цепи интронной РНК дает возможность присоединения гексозы к остатку глюкуроновой кислоты по связи 4 (или 3) -1 при матричном биосинтезе полисахарида (рис. 24).

«Смысловая» последовательность РНК начала второго участка 5’-конца экзонной зоны в виде обязательной последовательности Г-Г является началом кодона аминокислоты глицина (ГГА, ГГГ, ГГЦ, ГГУ). Находясь в зоне трисахарида (зона ветвления РНК), благодаря фланкирующим последовательностям интрона на процессингосоме, она продолжает первичную структуру м-РНК после серинового кодона в направлении 5’-3’ при созревании молекулы. Именно наличием обязательного димера гуанозина сайта сплайсинга в триплете, следующим за сериновым кодоном, можно объяснить консервативность звена ксилозилирования коровых белков (тандем серинглицин), поскольку два гуанозина в триплетном кодоне имеет только глицин.

Рис. 24. Гипотетическая схема генетически детерминированного матричного синтеза протеогликанов Данный транскрипт способен вести синтез полипептидной цепи, в которой аминокислота серин ковалентно связана с трисахаридом и далее с глициновой аминокислотой. На тандемных транскриптах РНК, являющихся интронной боковой цепью в продолжении тетрасахарида (ксилоза-галактоза-галактоза-уроновая кислота), возможна сборка полисахаридного фрагмента по принципу комплементарности нуклеиновая кислота – моносахариды с помощью гликозилтрансфераз, которые отвечают только за формирование гликозидных связей в направлении 4 (или 3) - 1 от остатка последнего сахарида. После сплайсинга и ухода двух гуанозинов в экзонную часть молекулы цепь тандемных РНК концевым уридином соединяется с С2 остатка уроновой кислоты.

Выстраивание моносахаридов для биосинтеза цепи полисахарида осуществляется фрагментом рибонуклеиновой кислоты. Этот процесс энергетически выгоден (энергия связи около 7 ккал/моль) в системах с избытком УДФ-сахаридов и гликозилтрансфераз, а также недостатком мононуклеотидов и НК-полимераз, что характерно для мембранных структур эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. Данный процесс может быть обозначен термином «гликотранскрипция», поскольку в ходе него информация от нуклеиновых кислот передается напрямую в цепь полисахаридного фрагмента.

Не вызывает сомнений, что рибосомы в состоянии вести синтез полипептидной цепи белкового кора, поскольку тетрасахаридное звено не занимает связь 3’-5’ последнего нуклеотида серинового триплета и является спейсером интронной области молекулы РНК.

Таким образом, по-видимому, вновь синтезированный коровый белок содержит связующий тетрасахарид и интронный фрагмент РНК на серине, который поступает на участок синтеза соответствующего полисахаридного фрагмента мембранных комплексов ЭПР и аппарата Гольджи после формирования полипептидной цепи. Процесс ксилозилирования серина осуществляется в ЭПР в момент биосинтеза коровых белков на рибосоме. Это не противоречит современным представлениям о биосинтезе ГАГ [32].

Необходимо отметить, что сплайсинг пре-м-РНК носит тканеспецифический характер. Более того, в некоторых случаях выбор сайта сплайсинга зависит от стадии развития организма [2]. Таким образом, первичная структура интронной зоны в пре-мРНК имеет не только тканеспецифичность, но и различна на разных этапах развития организма.

То же самое можно констатировать и в отношении первичной структуры гликозидной части молекул протеогликанов. Известно, что протеогликаны вообще отсутствуют у одноклеточных и прокариот, равно как и процессинг пре-мРНК. Это делает биосинтез гликанов и «созревание» молекул м-РНК взаимосвязанными процессами в их биологической значимости для клетки.

В пользу этой версии могут свидетельствовать данные, полученные на м-РНК коровых белков хондроитинсульфатов. Так, при осуществлении трансляции м-РНК хрящевой ткани в бесклеточной системе трансляции зародышей пшеницы было показано, что данная м-РНК формирует коровый белок с молекулярной массой в 340000 Да. Этот полипептид уже сразу после трансляции содержал «сигнальные» участки гликозилирования для последующего процесса синтеза гликанов[64], то есть имел связующий тетрасахарид.

Предложенная гипотетическая схема матричного синтеза протеогликанов с участием нуклеиновых кислот (рис. 24), основанная на квантово-химических расчетах энергетической целесообразности формирования связей, не вступает в противоречие с представлениями о процессах реализации генетической информации (структура генома, транскрипция, процессинг и сплайсинг гя-РНК, трансляция) [2] способна снять основные противоречия в существующем представлении метаболизма протеогликанов. С ее позиции не сложно объяснить, почему более чем полувековые исследования протеогликанов не дали возможность однозначно установить место формирования связующего тетрасахарида белковой молекулы протеогликана, поскольку тетрасахарид может содержаться в структуре РНК до момента трансляции. В литературе однозначно показано, что тетрасахарид появляется в ЭПР уже ковалентно связанным с коровым белком. [4, 32] Версия участия структур белкового кора в сайте ксилозилирования остатка серина отпала сама по себе в последних исследованиях данного вопроса. Однако взамен этих воззрений формулируется «виталистическая» гипотеза, по которой уже внутриклеточным мембранам приписываются функции определения места ксилозилирования остатков серина. Как указывают авторы, данное предположение базируется на положении, что основная масса гликозилтрансфераз детектируется в мембранных структурах ЭПР и аппарата Гольджи [32], что само по себе не является доказательством синтеза в этих структурах связующего тетрасахарида, поскольку гликозилтрансферазы детектируются и в ядрах (ядерные мембраны). Биохимические исследования, проведенные нами в настоящей работе, свидетельствуют о причастности именно структур клеточного ядра к инициации синтеза связующего тетрасахарида.

По предложенной нами концепции, ксилозилирванию подвергаются только те остатки серина, которые в ДНК после серинового триплета имеют стоп-кодон синтеза белка – АТТ и следующую за ним ЦА последовательность (в РНК - ГУ) интрона, отвечающего за ветвление гя-РНК и процессинг м-РНК.

Выше мы описали схему возможного синтеза протеогликана, которая позволяет формировать линейный гетерогликан заданной длинны (около 300 мономеров). Остается не ясным вопрос, каким образом, согласно предложенной концепции, может осуществляться матричный синтез гиалуроновой кислоты, размер которой составляет тысячи мономерных звеньев. Ясно, что РНК-матрица подобного размера в структурах ЭПР не детектируется. В этом случае процесс биосинтеза ГАГ может осуществляться на лассообразных структурах интронных РНК, получаемых в результате цис-сплайсинга, которые способны обеспечить циклизацию синтеза ГК с любым количеством мономеров.

Как известно, транс-сплайсинг м-РНК дает интрон линейной формы. На подобных структурах РНК в состоянии проходить матричный синтез разветвленных гомогликанов с шагом ветвления, кратным полному витку спирали НК (от 10 до 12), поскольку в подобных условиях 10(12) моносахарид полимера находится над 1 моносахаридом в формирующейся цепи. Это создает возможность образования между ними дополнительной связи. В дальнейшем синтез может осуществляться по замкнутой системе с образованием разветвленного полисахарида со структурой, подобной гликогену. На возможность существования подобной системы синтеза разветвленных полисахаридов указывает их степень ветвления, кратная полному витку спирали НК.

РНК с описанными структурами могут входить в состав мцРНК, роль которых до сих пор точно не установлена. Известно, что их количество в клетке составляет чуть менее 1% от общей массы РНК. Структура некоторых из них представлена тандемными повторами, в частности Alu-последовательности РНК. Локализация данных РНК ассоциирована с мембранными структурами ЭПР, более того, известно, что некоторые классы мцРНК участвуют в трансмембранном переносе полипептидов через липидный бислой ЭПР (7SL-РНК). Размер мцРНК варьирует от 90 до 330 нуклеотидов, что вписывается в представления предлагаемой концепции. Отметим, что вполне вероятно, синтез запасных (резервных) гомогликанов не требует матрицы и способен осуществляется по упрощенной схеме, поскольку их цепь не является информационной.

Как известно, многие гликопротеины являются антигенами плазматических мембран.

При сравнительном иммунохимическом анализе гликопротеинов, выделенных из мембран гепатоцитов (интактной, эмбриональной, регенерирующей печени и гепатомы) установлено, что белковая часть антигенов выявляется на всех гепатоцитах вне зависимости от состояния печени. Более того, она не тканеспецифична и универсальна для большинства групп клеток. В то время как углеводная часть антигенов обладает специфичностью. Именно структура полисахаридных фрагментов определяет иммуногенность протеогликана. В работе Зиминой Н.П. [29], при изучении особенностей синтеза ГАГ печени взрослых крыс, эмбрионов и гепатомы, было показано, что активно пролиферирующие ткани характеризуются пониженной степенью сульфатирования полисахарида по сравнению с соответствующими классами ГАГ в покоящихся тканях. Т.е клетки печени, находящиеся в различном состоянии, имеют не одинаковые полисахаридные фрагменты в структуре одного и того же протеогликана.

С позиции концепции не матричного синтеза ГАГ, формирование белкового кора осуществляется на полисомах шероховатой эндоплазматической сети. Во всех вышеописанных случаях, наблюдается синтез одних и тех же белковых молекул протеогликанов. Идентичность белкового кора свидетельствует в пользу того, что биосинтез гликозидной части молекулы осуществлялся в одном и том же участке гладкого ЭПР, что должно было бы приводить к синтезу идентичных гликановых фрагментов.

Результаты экспериментов этого не подтверждают. Подобный результат возможен только при условии изменения гликозилтрансферазных комплексов в мембранных структурах ЭПР клеток печени различного физиологического состояния. Подобный гликозилтрансферазный комплекс гладких ЭПР должен содержать около 300 единиц фермента, ведущего формирование гликозидной связи в определенной последовательности. К примеру, синтез гепарансульфата требует комплекса из примерно 300 N-ацетилглюкозаминилтрансфераз и глюкуронилтрансфраз в эквивалентном соотношении. Причем, каждая из 150 молекул, к примеру, Nацетилглюкозаминилтрансферазы, должна кодироваться отдельным геном, отличающимся не консервативной последовательностью сайта, отвечающего за связывание фермента со строго специфичным участком мембраны гладкого ЭПР. Если принять за основу концепцию не матричного синтеза ГАГ, формирование только гепарансульфатов требует как минимум трех видов подобных комплексов. Количество генов Nацетилглюкозаминилтрансфераз, необходимых для осуществления данного процесса исчисляется порядка 450 единиц. Если к этому добавить еще синтез гепарина и других полисахаридов, в которых задействован данный фермент, счет необходимых генов Nацетилглюкозаминилтрансфераз в клетке должен исчисляться тысячами на геном. Как известно, участки ДНК, комплементарные информационной РНК в геноме относятся к уникальным последовательностям, с количеством до нескольких копий на геном, и гены гликозилтрансфераз в этом плане не являются исключением. Следовательно, принятая на сегодня концепция не матричного синтеза ГАГ, не способна объяснить факт существования генетически детерминированной гетерогенности полисахаридных фрагментов протеогликанов. В целом же, гипотеза нематричного синтеза протеогликанов, не выдерживает критики при анализе последних работ разных авторов [28, 29], доказывающих информационную емкость гликозидной части протеогликанов.

Предложенная нами схема матричного синтеза ГАГ позволяет решить эту проблему, поскольку для формирования гликозидной части молекулы, в этом варианте, достаточно всего лишь нескольких копий генов гликозилтрансфераз для синтеза любого разнообразия полисахаридной цепи.

Синтез части информационно емких гликанов по принципу гликотранскрипции предполагает возможность, по аналогии с РНК, процесс обратной гликотранскрипции, когда информация от полисахарида, может быть перенесена в РНК, а затем посредством ревертаз в ДНК-фрагменты, которые способны встраиваться в геном и таким образом сохранять приобретенную информацию о новых гликанах в структуре генома. Подобная информация представлена специфическими тандемными повторами ДНК, которые уникальны для каждой особи. Эти генетические системы, вероятно, способны передаваться по наследству и закрепляться отбором как врожденный и приобретенный иммунитет. По-видимому, в природе имеет право на существование как не матричный, так и генетически детерминированный матричный синтез полисахаридов, которые тесно взаимосвязаны между собой по потокам информации.

В этой связи отметим, что в работах Роничевской и др.[65] было описано кейлоноподобное свойство гликозаминогликанов подавлять репликацию ДНК пролиферирующих клеток. Мы можем объяснить это явление гомологичностью полисахаридов нуклеиновым кислотам. На наш взгляд, за счет специфического связывания с комплементарными участками повторов ДНК полисахаридные фрагменты в состоянии блокировать работу ДНК-полимераз. Причем, как сообщала ранее эта группа исследователей, данные вещества ими были получены из препаратов РНК, что может служить косвенным указанием причастности РНК к синтезу гликанов. По крайней мере, по нашим данным фрагменты гиалуроновой кислоты формировали устойчивые связи с НК.

Дальнейшее изучение вопроса полиморфизма протеогликанов (видового, тканевого, возрастного, патологических изменений) с постановкой методов секвенирования, вероятно, покажет их специфичность и на уровне отдельного организма.

Так, на сегодня, не вызывает сомнения полиморфизм частых повторов генома, широко используемый в генной дактилоскопии особи. По нашим предположениям, именно повторы генома отвечают за информационную структуру гликанов, полиморфизм (микрогетерогенность) которых становится общепризнанным фактом.

Результаты многих исследований позволяют говорить об участии протеогликанов в сложнейших процессах регуляции пролиферации клеток [65], их дифференцировки [66, 67], в межклеточном узнавании и организации межклеточных взаимодействий [68]. Роль полисахаридов в эволюции можно определить как ключевую при переходе от одноклеточных организмов к многоклеточным образованиям. Именно полисахариды позволяют функционировать отдельной клетке как структуре с определенной функцией в клеточном ансамбле организма в целом. В онтогенезе протеогликаны связаны с процессом старения клеток, тканей и органов [69]. Генетически детерминированный дефект синтеза гликозаминогликанов по полисахаридной цепи приводит к тяжелым генетическим заболеваниям [5]. Нет сомнения в том, что данные процессы управляются при непосредственном участии ДНК, которая является носителем всей генетической информации.

Подводя итог, можно констатировать, что жизнь есть форма существования не только белковых и нуклеиновых тел, но и в не меньшей степени полисахаридных, поскольку эти три биополимера определяют жизнь в той форме, в которой мы ее наблюдаем. Изучение несомненной взаимосвязи НК с полисахаридами, позволит оценить роль, как самих полисахаридов, так и тандемных повторов ДНК, которые на сегодняшний день уже нельзя определять как «мусорные» или «эгоистические», поскольку, повидимому, часть из них способна отвечать за синтез полисахаридов.

Авторы выражают благодарность В.И.Салянову (Институт молекулярной биологии РАН, Москва) за содействие в получении и интерпретации эмпирического материала по спектофотометрическим исследованиям.

Работа выполнена при финансовой поддержке Закрытого акционерного общества «Плазан», Москва.

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Киселев Л.Л. 2000. Геном человека и биология XXI века. Вестник Российской Академии Наук. 70, c. 414- 424.

2. Сингер М., Берг П. 1998. Гены и геномы. М., «Мир», 764 с.

3. Медников Б.М., Шубина Е.А., Мельникова М.Н.2001. Молекулярные механизмы генетической изоляции. Природа, 5, c.19-28.

4. Кольман Я., Рем К.-Г. 2000. Наглядная биохимия. М.: Мир, 469 с.

5.Зимницкий А.Н., Башкатов С.А. 2004. Гликозаминогликаны в биохимических механизмах адаптации организма к некоторым физиологическим и патологическим состояниям. М.: Глобус, Фармацевтический Бюллетень, 208с.

6. Dorfman A. Studies on the biochemistry of connective tissue. Pediatrics. 1958 Sep;22(3). p.

576-589.

7. Dorfman A. Metabolism of acid mucopolysaccharides. Biophys J. 1964 Jan;71:SUPPL. p.

155-165.

8. Dorfman A. In: Structure and Function of Connective and Skeletal Tissue. London, 1965, p.

178- 297.

9. Glaser L., Brown D.H. Purification and properties of d-glucose-6-phosphate dehydrogenase.

Proc. Natl. Acad. Sci. US, 1955, 41, p. 253

10. Glaser L, Brown DH. Purification and properties of d-glucose-6-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 1955 Sep;216(1). p. 67-79.

11. Roseman S., Ludowieg J, Moses F., Dorfman A. The biosynthesis of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid. Arch Biochem Biophys. 1953 Feb;42(2). p. 472-473.

12. Roseman S., Moses F.E, Ludowieg J, Dorfman A. The biosynthesis of hyaluronic acid by group A Streptococcus. I. Utilization of 1-C14-glucose. J Biol Chem. 1953 Jul;203(1). p.213Roseman S., Moses F.E, Ludowieg J, Dorfman A. The biosynthesis of hyaluronic acid by group A Streptococcus. II. Origin of the glucuronic acid. J Biol Chem. 1954 Feb;206(2). p.665Cifonelli J.A., Dorfman A. J. The biosynthesis of hyaluronic acid by group A streptococcus.

V. The uridine nucleotides of group A streptococcus.J Biol Chem. 1957 Oct;228(2). p.547-557.

15. Markovic O., Huttl S. Contribution to a methodical approach to determination of protein and glycoprotein components in synovial fluid. Cas Lek Cesk. 1964 May 8;103.p.522-5225..

16. Markovitz A., Cifonelli J.A., Dorfman A.Biosynthesis of hyaluronic acid by cell-free extracts of group-A streptococci. Biochim Biophys Acta. 1958 May;28(2) p.453-455.

17. Lorenzel I. Epinephrine-induced alterations in connective tissue of aortic wall in rabbits.

Proc Soc Exp Biol Med. 1959 Nov;10, p.440-442.

18. Schiller S. 1964Synthesis of hyaluronic acid by a soluble enzyme system from mammalian tissue. Biochem Biophys Res Commun. 26;15(3). p. 250-255.

19. Schiler S. Structure and Function of Connective and Skeletal Tissue. London, 1965, p.302.

20. Altschuler C.H. Kinsman G., Bareta J. Connective tissue metabolism. I. Hyaluronic acid synthesis by cell-free extracts of human tissues.Arch Pathol. 1963 Feb;75. p. 206-211.

21. Strominger J.L. Nucleotide intermediates in the biosyntesis of heteropolimeric polysaccharides. Biophys J. 1964 Jan;71:SUPPL. p. 139-153.

22. Слуцкий Л.И. 1969. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. Л.: Медицина, 1969.- 376с.

23. Maley F., Maley G.F. The enzymic conversion of glucosamine to galactosamine. Biochim Biophys Acta. 1959 Feb;31(2). p.577-578.

24. Roden L., Dorfman A. The metabolism of mucopolysaccharides in mammalian tissues. V.

The origin of L-iduronic acid. J Biol Chem. 1958 Nov;233(5). p. 1030-1033.

25. Rondle C.J.M., Morgan W.T.The determination of glucosamine and galactosamine.

Biochem J. 1955 Dec;61(4). p. 586-589.

26. White B.N., Shetlar M.R., Shurley H.M., Shilling J.A. Incorporation of (1-14C)Glucosamine into mucopolysaccarides of rat connective tissue. Biochim Biophys Acta. 1965 Mar 1;101. p. 97Silbert J. J. Incorporation of 14C and 3H from nucleotide sugars into a polysaccharide in the presence of a cell-free preparation from mous mast cell tumors.J Biol Chem. 1963 Nov;238. p.

3542-3546.

28. Зимина Н.П., Рыкова В.И., Архипов И.А. Протеогликаны животных тканей как нерегулярные биополимеры: информативность структуры и контроль биосинтеза // Успехи современной биологии. - 1992. - Т.112. - Вып. 4. - c.571-588.

29. Зимина Н.П., Дмитриев И.П., Рыкова В.И. Состав и степень сульфатирования гликозаминогликанов из тканей животных различных видов: гетерогенность и тканевая специфичность гепарансульфатов. // Биохимия - 1987. - Т.52. - Вып. 6. - c.984-990

30. Серов В.В. Соединительная ткань / В.В. Серов, В.Б. Шехтер / – М.: Медицина, 1981. с.

31. Уайт. Дж. Основы биохимии. - М.: Мир, 1982. - Т.3. - 232с.

32. Silbert J.E. Sugumaran G.Intracellular membranes in synthesis, transport, and metabolism of proteoglycans Biochim. Biophys. Acta. – 1995. - Vol. 1241. - №3. – p.371-384.

33. Jeffrey D Esko., Zhang L. Influence of core protein sequence on glycosaminoglycan assembly Current Opinion in Structural Biology. – 1996. – Vol.5. – p. 663-670.

34. Kazuyuki Sugahara., Hiroshi Kitagawa. Recent advances in the study of the biosynthesis and functions of sulfated glycosaminoglycans.Current Opinion in Structural Biology. – 2000. – Vol.10. - №5. – p.518-527.

35. Silbert J.E. Structure and metabolism of proteoglycans and glycosaminoglycans J. Invest.

Dermatol. - 1982. – Vol.79. - №1. – p.31-37.

36. Lindahl U., Kjellen L.// Biology of proteoglican. Eds Wight T.N., Mecham R.P. Orlando:

Acad. Press. 1987. 59 p.

37. Cybulski S.M., Scheiner S.J.1989. Hydrogen bonding and proton transfers involving the carboxylate group J. Am. Chem. Soc., 111, p. 23-31.

38. Latajka Z. Scheiner S.J. 1990, Structure, energetics, and vibrational spectrum of ammonia...water J. Phys. Chem., 94, p. 217-221.

39. Williams I.H.1987. Theoretical modelling of specific solvation effects upon carbonyl addition J. Am. Chem. Soc., 109, p. 6299-6307.

40. Dewar M.J.S., Zoebisch E.G., Healy E.F., Stewart J.J.P.1985. Development and use of quantum mechanical molecular models. 76. AM1: a new general purpose quantum mechanical molecular model J. Am. Chem. Soc., 107, p. 3902-3909.

41. Sterwart J.J.P. 1989. Optimization of parameters for semiempirical methods. II.

Applications J.Comput.Chem. 10, p. 221-261.

42. Jurema JM. W., Shields G.C.1993. Ability of the PM3 quantum-mechanical method to model intermolecular hydrogen bonding between neutral molecules J. Comput. Chem., 14, p. 89-104.

43. Kallies B., Mitzner R. 1995. The ability of the semiempirical PM3 method to model proton transfer reactions in symmetric hydrogen bonded systems J. Mol. Model., 1, p. 68-78.

44. Schmidt M.W., Baldridge K.K., Boatz J.A.,.Elbert S.T., Gordon M.S., Jensen J.H., Koseki S., Matsunaga N., Nguyen K.A., Su S.J., Windus T.L.,.Dupuis M., Montgomery J.A.. General atomic and molecular electronic structure system 1993. J.Comput.Chem. 14, p.1347-1363.

45. Белозерский АН. 1970.Методы исследования нуклеиновых кислот. М., Мир, 278 с.

46. Дунин В.В., Рухадзе Е.Г., Потапов В.М. 1979. Получение и исследование оптически активных вещест, М., Изд-во Моск. ун-та, 328 с.

47. Maxam A., Gilbert W.1977.A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 74, p.560-564.

48. Denhardt D.T.1966. A membrane-filter technique for detection of complementary DNA.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, p. 641-652.

49.Jermyn M. A. 1975. Increasing the Sensitivity of the Anthrone Method for Carbohydrate.

Analytical biochemistry. v. 68, p.332-335.

50. Chaplin M. F., Kennedy J. F. 1986. Carbohydrate analysis. A practical approach. Oxford, Wachigton, 456p.

51. Современные методы в биохимии. 1968. /Под ред. В.Н. Ореховича. М.: Медицина, 372с.

52. Mulliken R.S. 1955. Electron Population Analysis on LCAO-MO Molecular Wave Functions. II. Overlap Populations, Bond Orders, and Covalent Bond Energies J. Chem. Phys., 23, p. 1841-1846.

53. Биохимический справочник.1979. Киев, Вища школа, 304 c.

54. Робертс Дж., Касерио М. 1978.Основы органической химии. М., Мир, 320 с.

55. Благой Ю.П., Галкин В.Л., Гладченко Г.О., Корнилова С.В. 1969. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. Киев, Наукова думка, 74 с.

56. Yang J.T., Samejima T. 1969. Optical rotatory dipersion and circular dichroism of nucleic acids.in Progress in Nucleic acids research and Molecular Biology, J.N. Lavidson and W.E.Cohn, eds., Academic, N-Y, p.223-238

57. Зеленин А.В. 2003. Геном растений. Вестник Российской Академии Наук. 73, c.797Зимина Н.П., Рыкова В.И. 1986. Протеогликаны животных тканей и их влияние на синтез ДНК. Биохимия. 51, p.1555-1561

59. Зимина Н.П. Рыкова В.И., Дмитриев И.П.1987. Сравнительная характеристика состава и степени сульфатирования гликозаминогликанов покоящихся и активно пролиферирующих тканей Биохимия. 52, c. 856-861

60. Fransson LA, Havsmark B. 1982. Structural requirements for heparan sulphate selfassociation. Carbohydr Res. 16, p.135-44.

61. Oegema T.R.Jr, Hascall V.C., Eisenstein R.1979.Characterization of bovine aorta proteoglycan extracted with guanidine hydrochloride in the presence of protease inhibitors.

J Biol Chem. 254, p.1312-8.

62. Bjork I., Lindahl. U. 1982. Mechanism of the anticoagulant action of heparin.

Mol. And Cell. Biochem. 18, p.161-82

63. Franson L-A. 1982. Structural features of the contact zones for heparan sulphate selfassociation. Carbohydr. Res. 110, p.127-33

64. Hook M., Kjellen L., Jahansson S., Robinson J.1984. Cell-surface glycosaminoglycans.

Annual Rev. Biochem. 53, p. 847-69

65. Роничевская Г.М., Рыкова В.И.1977. Исследование органной специфичности антимитотического действия гликопептидов, выделенных из препаратов РНК. Доклады АН СССР. 237, p. 481-483

66. Kinoshita S., Saiga H. 1979. The role of proteoglycan in the development of sea urchins.The role of proteoglycan in the development of sea urchins. I. Abnormal development of sea urchin embryos caused by the disturbance of proteoglycan synthesis. Exp. Cell Res. 123, p. 229-36

67. Kinoshita S., Yoshii K. 1979. The role of proteoglycan synthesis in the development of sea urchins. II. The effect of administration of exogenous proteoglycan. Exp. Cell Res. 1979. 123, p. 361-369

68. Henkart P., Humphreys S., Humphreys T. 1973. Characterization of sponge aggregation factor. A unique proteoglycan complex. Biochemistry. 12, p. 3045-50

69. Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., Петренко Е.Г., Хуснутдинова С.Б. 2004.

Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов в коже у женщин.

Биомедицинская химия. 50. c. 309-313



Похожие работы:

«ФИЗИКА, 11 класс Анализ результатов. Март 2014 АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ Краевой диагностической работы по ФИЗИКЕ 11 класс (21 марта 2014 г.) В написании КДР в марте 2014 г приняли участие только учащиеся, намеренные сдавать экзамен по физике в форме ЕГЭ. Количество таких...»

«Журнал прикладной химии. 2000, т.78, № 8 СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ВОДООЧИСТКЕ ГИДРОКСОХЛОРИДА И СУЛЬФАТА АЛЮМИНИЯ В ОТСУТСТВИЕ И В ПРИСУТСТВИИ ПОЛИАКРИЛАМИДА © В.Ф. Куренков, С.В. Снигирев, Ф.И. Чуриков Казанский государственный технологический университет Проведена сравнит...»

«Лекция: Кольца. Теорема о конечном целостном кольце. Кольцо многочленов. Подкольцо. Идеал кольца. Главный идеал кольца. Кольцо главных идеалов. Деление с остатком многочленов над полем. Теорема о кольце многочленов над полем...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт геологии РУДНЫХ месторождений; петрографии, минералогии и геохимии Геологический институт Кольского научного центра Российский фонд фундаментальных исследований COPPER-NIКEL DEPOSITS OF ТНЕ PECHENGA Editor ofVolum academician RAS N.P.L...»

«РЗ-2010-29 В. И. Юревич*, P.M. Яковлев1, В. Г. Ляпин1 ОБРАЗОВАНИЕ НЕЙТРОНОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ПРОТОНОВ С ЭНЕРГИЕЙ 2 ГэВ С ЯДРАМИ Направлено в журнал "Ядерная физика" *E-mail: yurevich@sunhe.jinr.ru ФГУП НПО Радиевый институт им. В. Г. Хлопина, Санкт-Петербург Юр...»

«Известия НАН Армении, Физика, т.45, №5, с.350-364 (2010) УДК 577.352.2 МОДЕЛИРОВАНИЕ И РАСЧЕТ СВЕТОАДРЕСУЕМЫХ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ Ф.В. ГАСПАРЯН Ереванский государственный университет, Армения (Поступила в редакцию 30 октября 2009 г.) Представлены результаты моделирования и те...»

«УДК 550.837 ГЕОКРИОЛОГИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ ПОЙМЕННЫХ И НАДПОЙМЕННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ Р. ЮРИБЕЙ (ЯМАЛ) ПО ДАННЫМ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ЗОНДИРОВАНИЙ Владимир Владимирович Оленченко Институт нефтегазовой геологии и геофизики СО РАН, 630090, г. Новосибирск, пр-т А...»

«Технологии и оборудование для подготовки поверхности Окрасочные и сушильные камеры. Автоматизация процессов нанесения покрытий • Установки дробеметнои очистки и консервации для профильного, сортового и листового проката • Камеры дробеструйной очистки для готовых узлов и изделий • Окрасочные и сушильные камеры • Электростатическое нанесение пок...»

«Жюль Анри Пуанкаре (1854 — 1912) французский математик, физик, астроном и философ “Если бы природа не была столь прекрасной, она не стоила бы того, чтобы быть познанной, а жизнь не стоила бы того, чтобы быть прож...»

«Министерство общего и профессионального образования РФ ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Физический факультет Кафедра теоретической физики ЗАПРЯГАЕВ С. А. МАГНИТОСТАТИКА Методические указания к практическим занятиям по курсу ЭЛЕКТРОДИНАМИКА для студентов 3-го курса дневно...»

«Металлофиз. новейшие технол. / Metallofiz. Noveishie Tekhnol. 2015 ИМФ (Институт металлофизики 2015, т. 37, № 2, сс. 149—155 им. Г. В. Курдюмова НАН Украины) Оттиски доступны непосредственно от издателя Фотокопир...»

«Инструкция по охране труда на уроках математики и 25-03-2016 1 Арагонские дверки неправдоподобно полушепотом не кокают совестливых кокарды блокадной ретиной. Проповедническое лидерство полыхает. Прогрессирующий медалист воспитанного калейдоскопа атлетически распаковывается. Бетонированная бесценность кусается! Необоримая опально...»

«.. ДОБРОТИН -судить по вывеске. Вопреки общей тенденции резко отделять тематику одних лабораторий от тематики других, я хочу сказать, что по практическим соображениям это неосуществимо. Содержание тематики в ряд случаев должно выходить за рамки официально...»

«Здоровье – это способность противостоять воздействиям инфекции, физических, химических и психических факторов окружающей среды.Современное определение здоровья ребенка содержит пять признаков: • адаптируемость – приспособляемость к окружающей среде;• р...»

«"Школа "Раннего развития" "Математическая логика" 1 год обучения 1 группа Бердичевский Евгений 1. Верулашвили Григорий 2. Весловский Егор 3. Зызина Дарья 4. Калашников Аркадий 5. Карадениз Аиша 6. Карасев Даниил 7. Семина Мария 8. Таюрский...»

«1 31-я ВККЛ, Москва, МГУ, 2010 ПКЛ/PCR_38 Возможность преодоления предела Грейзена – Зацепина – Кузьмина за счет приближенного расширения лоренцевой симметрии до конформной в пределе сверхвысоких энергий Ю.Г.Рудой1, И.А. Вернигора2 Российский университе...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук (ИФХЭ РАН) Рабочая программа дисциплины Физико-химические методы исследования поверхностных явлений по...»

«В.В. Афанасьев НЕОТЛОЖНАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ РУКОВОДСТВО ДЛЯ ВРАЧЕЙ УДК 615.9(083.13) ББК 52.8 А94 Афанасьев В.В. А94 Неотложная токсикология. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 384 с. : ил. ISBN 978-5-9704-1834-5 Руководство по...»

«ФЭИ-413 ФИЗИКО-ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ' А. В. ЖУКОВ. А. Б. МУЖАНОВ, А. П. СОРОКИН, П. А. ТИТОВ, П. А. УШАКОВ МЕЖКАНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЕПЛОНОСИТЕЛЯ В РЕШЕТКАХ ЦИЛИНДРИЧЕСКИХ СТЕРЖНЕЙ Обнинск—1973 ФЭ0 ИНСТИТУТ А. йдуков, А.Б. М...»

«Почвоведение УДК 630.114 (571.6) Е.А. Жарикова, Е.Н. Толстоконева СВОЙСТВА БУРОЗЕМОВ РАЗЛИЧНЫХ ПАРЦЕЛЛ ШИРОКОЛИСТВЕННОГО ЛЕСА ЮЖНОГО ПРИМОРЬЯ Физико-химические свойства почв различных парцелл дубового леса Южного Приморья варьируют в зависимости от флористического состава и величины проективного покрытия травянистого нап...»

«Корпорация Укртеплоэнерго ИНЖЕНЕРНЫЙ ЦЕНТР ТЕПЛОСНАБЖЕНИЯ Общество с ограниченной ответственностью Украина, г. Киев, 03190, ул.Черняховского, 16/30, тел (044) 422-22-72, факс (044) 422-23-39 БЛОК ТЕПЛООБМЕННЫЙ МОДУЛЬНЫЙ РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ 31777042.02.00.00 КЕ Киев 200г. Это руководство по эксплуатации предназначено для ознакомления с...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ФГБОУ ВПО "ИГУ" Кафедра общей и неорганической...»

«Московский государственный университет путей сообщения (МИИТ) Кафедра "Безопасность жизнедеятельности" М. А. Ершов О.А. Лерке Приборы радиационной, химической разведки и дозиметрического контроля Методические указания Рекомендо...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК В.А.Ацюковский Материализм и релятивизм Критика методологии современной теоретической физики К 100-летию выхода в свет книги В.И.Ленина "Материализм и эмпириокритицизм" Москва 2009 г. УДК 530.12 Ацюковский В.А. Материализм и релятивизм. Критика методологии современной теоретической физики....»

«Геология и геофизика, 2015, т. 56, № 3, с. 595—607 УДК 553.21/24 КАРБОНАТИТОВЫЕ РАСПЛАВЫ И ГЕНЕЗИС АПАТИТОВОГО ОРУДЕНЕНИЯ НА ГУЛИНСКОМ ПЛУТОНЕ (север Восточной Сибири) А.Т. Исакова1,2, Л.И. Панина1, Е.Ю. Рокосова1,2 Институт геологии и минералогии им. В.С. Соболева СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Коптюга, 3, Россия Новосибирс...»

«му миру [Паршин, 2001]. Анализ рекламного пищевого дискурса позволяет предположить, что он развивается по пути сочетания интернационального и национального: и в названиях, и в слоганах и в видеоряде все чаще присутствуют национальные ценности: вспомним сок "Д...»








 
2017 www.ne.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.