WWW.NET.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Интернет ресурсы
 

«ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ НЕБЛАГОПРИЯТНЫМИ ВАРИАНТАМИ ОСТРОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА И МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКОГО СИНДРОМА ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ

ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА»

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

На правах рукописи

Кострома Иван Иванович

ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ

НЕБЛАГОПРИЯТНЫМИ ВАРИАНТАМИ ОСТРОГО МИЕЛОИДНОГО

ЛЕЙКОЗА И МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКОГО СИНДРОМА

14.01.21. – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Грицаев С.В., доктор медицинских наук Капустин С.И., доктор биологических наук Санкт-Петербург

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................. 4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОСОБЕННОСТИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ

НЕБЛАГОПРИЯТНЫМИ ВАРИАНТАМИ ОМЛ И МДС................ 12

1.1. Метилирование промотерных областей генов как один из механизмов лейкозогенеза и “мишень” для лекарственного воздействия при лечении больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС...... 12



1.2. Децитабин и 5-азацитидин в лечении больных ОМЛ и МДС 18

1.3. Комбинированная терапия низкой интенсивности для лечения больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС............. 22 Глава 2. ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............. 28

2.1. Объект и материалы исследования.............................. –

2.2. Лабораторные методы......................................... 29

2.3. Верификация прогноза, моносомного кариотипа и критерии оценки эффективности терапии....................................... 32

2.4. Схемы терапии гипометилирующим

–  –  –

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы и степень ее разработанности Отличительной особенностью ОМЛ и МДС является клиническая, гематологическая, гистологическая и молекулярно-биологическая вариабельность [3, 5, 11, 50, 115, 131]. Отражением биологической гетерогенности ОМЛ является разный ответ на проводимую терапию, проявляющийся, в частности, резистентностью к стандартным курсам ИР или рецидивом на фоне проводимой постремиссионной ХТ [5, 11, 22, 60, 83, 100, 127]. Лечение рецидивов, особенно ранних, диагностированных во время или непосредственно после окончания ВДХТ, и резистентных вариантов ОМЛ – одна из сложнейших задач онкогематологии [10], так как на период поиска HLA-совместимого донора необходимо решить две принципиальные задачи: во-первых, снизить объем патологического клона и, во-вторых, сохранить удовлетворительный соматический статус больного [1]. Возможности ВДХТ по преодолению резистентности лейкозных клеток ограничены, а риск возникновения тяжелых, сопряженных с летальным исходом, токсических осложнений от повреждающего воздействия кумулятивных доз ХП велик.




В связи с этим особую актуальность приобретает разработка комбинированных схем ХТ низкой интенсивности [11, 20, 42, 77, 116]. Одной из перспективных опций является включение пуриновых аналогов, в том числе и кладрибина, в состав схемы с введением низкодозного Ара-Ц [132]. Единичные сообщения в литературе и отсутствие указаний на подобные комбинации в национальных руководствах определяют актуальность клинической апробации схемы “малые дозы Ара-Ц с кладрибином”.

Непосредственное участие эпигенетических механизмов в лейкозогенезе определило показания для включения гипометилирующих препаратов (азануклеозиды) в алгоритмы лечения больных ОМЛ и МДС высокого риска, которым по разным причинам не может быть назначена ВДХТ [4, 56].

Имеющиеся публикации свидетельствуют об эффективности Дако и 5-Аза у части больных миелоидными неоплазиями [8, 25, 59, 92, 126]. Однако, принимая во внимание особенности механизма действия, для поддержания достигнутого ответа рекомендуется постоянная терапия азануклеозидами. В связи с этим особую актуальность представляют попытки по выделению клиникогематологических показателей, ассоциированных с вероятностью достижения ответа, и определению вариантов ответа, сопряженных с улучшением ОВ.

Решение данной проблемы позволит научно обосновать целесообразность назначения и длительного введения азануклеозидов, а с другой стороны – выделить группу больных, которым оправдано усиление терапии гипометилирующими препаратами посредством их комбинации с цитостатиками.

Кариотип – высокоинформативный прогностический показатель, который с большой долей вероятности стратифицирует больных ОМЛ и МДС на группы риска [2, 50, 113, 115]. Многообразие вариантов цитогенетических повреждений, обнаруживаемых у больных миелоидными неоплазиями, является основанием для дальнейшего определения прогностической ценности отдельных хромосомных аберраций. Одним из новых прогностических вариантов кариотипа, обнаружение которого ассоциировано со значимым ухудшением ОВ, является моносомный кариотип [44, 89, 90]. В то же время нерешенной и весьма актуальной остается проблема вариабельности течения ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом, что представляется важным с точки зрения планирования поиска HLA-совместимого донора и выполнения АллоТГСК. Не менее актуальной остается и проблема сроков интенсификации противолейкозной ХТ: или на этапе ИР, или в постремиссионном периоде. Тем самым, анализ ОВ больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом поможет сформулировать новые положения алгоритма лечения больных миелоидными неоплазиями.

Один из механизмов лечебного действия азануклеозидов обусловлен реэкспрессией генов-супрессоров опухоли в результате ингибирования ДНКметилтрансфераз [7, 27, 80, 81]. В то же время было продемонстрировано, что аберрантное метилирование большого числа генов сопряжено с прогрессией и значимым ухудшением эффективности гипометилирующих препаратов [12, 54, 93, 103, 108]. Не исключено, что этим, отчасти, объясняются низкие показатели ответа и ОВ у больных ОМЛ и МДС с множественными хромосомными аберрациями. Вместе с тем, в литературе практически отсутствуют данные об ассоциации аберрантного статуса метилирования нескольких генов, принимающих непосредственное участие в лейкозогенезе, с отдельными клиникогематологическими вариантами ОМЛ и МДС. Тем самым, особую актуальность приобретает проблема изучения статуса метилирования не менее 3–5 генов одновременно и поиска корреляции аберрантного статуса генов с отдельными вариантами миелоидных неоплазий. Выделение морфологических и цитогенетических параметров, сопряженных с гиперметилированием 3–5 генов, может быть основанием для интенсификации терапии путем добавления ХП к азануклеозидам. Решение данной проблемы послужит основанием для инициации новых клинических исследований и предоставит возможность внести коррективы в алгоритм лечения больных ОМЛ и МДС высокого риска в виде ранней модификации лечебного пособия больным с гиперметилированием избыточного числа генов. Обнаружение аберрантного метилирования у значительного числа больных МДС низкого риска может рассматриваться как обоснование включения азануклеозидов в схемы лечения больных без избытка бластных клеток.

Цель исследования

Исследовать эффективность отдельных вариантов терапии низкой интенсивности больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС и разработать способы дальнейшего улучшения результатов их лечения на основе оценки прогностической значимости моносомного кариотипа, статуса метилирования генов p15INK4b, SOX7 и антагонистов сигнального пути Wnt.

Задачи исследования

1. Изучить клиническую эффективность новой схемы комбинированной терапии “малые дозы цитарабина с кладрибином” для лечения больных рецидивом и резистентным вариантом ОМЛ.

2. Изучить частоту и характер ответа больных ОМЛ и МДС на терапию азануклеозидами (децитабин, 5-азацитидин), а также клинико-гематологические показатели, ассоциированные с улучшением выживаемости.

3. Охарактеризовать больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом.

4. Исследовать статус метилирования генов p15INK4b, SOX7 и антагонистов сигнального пути Wnt у больных ОМЛ и МДС и выявить сопряженность аберрантного статуса метилирования с морфологическими вариантами заболеваний и характером цитогенетических поломок.

Научная новизна

В процессе выполнения исследовательской работы были установлены эффективность и приемлемый профиль токсичности терапии низкой интенсивности “малые дозы цитарабина с кладрибином”, обосновывающие целесообразность ее включения в алгоритм лечения больных рецидивом и резистентным ОМЛ, которым по разным причинам не может быть назначения высокодозная химиотерапия.

Выделены клинико-гематологические показатели, ассоциированные с эффективностью лечения больных ОМЛ и МДС азануклеозидами, что позволяет оптимизировать условия терапии гипометилирующими препаратами.

Выявлена гетерогенность больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом по клиническим, гематологическим и цитогенетическим показателям, а также по эффективности проводимой терапии. Продемонстрирована крайне низкая выживаемость основной части больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом, что дает основание рекомендовать инициацию лечения с курсов высокодозной химиотерапии.

Впервые обнаружено аберрантное метилирование генов у основной части больных благоприятными вариантами МДС, а также возрастание числа гиперметилированных генов при прогрессировании МДС.

Впервые выявлена сопряженность неблагоприятных вариантов ОМЛ (с множественными хромосомными аберрациями и с миелодисплазией) с аберрантным метилированием значительного числа генов. Полученные данные свидетельствуют о непосредственном вовлечении эпигенетических процессов в механизмы лейкозогенеза и позволяют внести коррективы в алгоритм лечения миелоидных неоплазий.

Теоретическая и практическая значимость работы

Дополнен список противорецидивных схем лечения больных ОМЛ новой схемой низкой интенсивности, посредством которой возможно редуцировать объем лейкозного клона и стабилизировать соматический статус больных на период подготовки к АллоТГСК.

Выявлены факторы, ассоциированные с улучшением общей выживаемости больных миелоидными неоплазиями при терапии азануклеозидами.

Продемонстрирована низкая эффективность стандартных индукционных курсов и высокая частота рецидивов у больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом.

Полученные данные позволили рекомендовать модификацию отдельных элементов алгоритмов лечения больных ОМЛ и МДС.

Обнаружены особенности статуса метилирования генов p15INK4b, SOX7 и антагонистов сигнального пути Wnt у больных ОМЛ и МДС, которые являются основанием для разработки новых подходов в лечении больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС, которым не показана стандартная или высокодозная химиотерапия, в ряде случаев эффективной может быть терапия низкой интенсивности: малые дозы цитарабина с кладрибином, гипометилирующие препараты.

2. Эффективность терапии низкой интенсивности больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС (частота ответа, медиана общей выживаемости) зависит от совокупности биологических и клинико-гематологических показателей: вид хромосомных аберраций, длительность курса, вариант ответа.

3. Принципиальным условием, определяющим выбор интенсивности индукционных курсов при диагностике ОМЛ и МДС, являются данные цитогенетического исследования, выполненного в дебюте заболевания.

4. Одним из механизмов формирования неблагоприятного варианта ОМЛ и МДС является повреждение эпигенетических процессов, в частности, аберрантное метилирование генов, принимающих участие в лейкозогенезе, что является другим принципиальным условием при выборе интенсивности лечебного пособия.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности результатов проведенного исследования подтверждается объемом наблюдений, набором и характером оцениваемых показателей, использованием современных статистических программ для обработки полученных данных.

Основные положения, материалы и результаты работы доложены и обсуждены на заседании школы гематологов «Миелодиспластический синдром» (СанктПетербург, 2013), II Конгрессе гематологов России (Москва, 2014);

III Евразийском гематологическом форуме (Новосибирск, 2014); VII съезде российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015);

IX Международном гематологическом симпозиуме памяти Р.М. Горбачевой (Сочи, 2015); 13 Международном симпозиуме по проблемам МДС (Вашингтон, 2015); 20 и 21 Конгрессах Европейской ассоциации гематологов (Вена, 2015;

Копенгаген, 2016); Конференции "Лейкозы и лимфомы. Терапия и Фундаментальные исследования” (Москва, 2015); Межрегиональной научнопрактической конференции с международным участием «Полиморбидность патологии – важнейшая проблема современного скоропомощного многопрофильного стационара», посвященная 55-летию СПб ГБУЗ «Городская больница № 15» (Санкт-Петербург, 2015); IV Евразийском гематологическом форуме XXII EAFO Oncopathology Seminar «Clinical Hematology», посвященном памяти профессора А.А. Новика (Санкт-Петербург, 2016); III Конгрессе гематологов России (Москва, 2016); II Евразийском конгрессе «Актуальные вопросы развития безвозмездного донорства» (Санкт-Петербург, 2016)

–  –  –

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, из которых 8 статей – в журналах, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.

–  –  –

На основании анализа отечественной и зарубежной литературы автором была определена актуальность научного исследования, сформулирована его цель и определены задачи для успешного решения поставленной цели, предложены оптимальные пути их решения с использованием оригинальных схем лечения и методов исследования. Диссертант принимал непосредственное участие в разработке концепции новой схемы терапии низкой интенсивности с применением малых доз цитарабина и кладрибина, определении критериев включении, отборе и лечении больных. Также автор участвовал в комплексном обследовании, лечении больных ОМЛ и МДС гипометилирующими препаратами и дальнейшем наблюдении за ними. Диссертантом создана электронная база данных больных ОМЛ и МДС, включенных в исследование. Самостоятельно проводил заготовку и обработку биологических материалов для последующих лабораторных исследований, проводил сбор анамнестических данных, результатов лечения и наблюдения. Освоил основные элементы лабораторных методов исследования, использованных в ходе выполнения диссертационной работы. Выполнил статистический анализ полученных результатов. Произведена интерпретация научной информации. Самостоятельно сформулированы выводы, практические рекомендации и основные положения, выносимые на защиту.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики пациентов и методов проведенных исследований, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы, включающего 11 отечественных и 129 зарубежных источников.

Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и содержит в своем составе 17 таблиц и 14 рисунков.

–  –  –

1.1. Метилирование промотерных областей генов как один из механизмов лейкозогенеза и “мишень” для лекарственного воздействия при лечении больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС Эпигенетические нарушения совместно с генетическими аберрациями и повреждением гемопоэтического микроокружения в костном мозге принимают непосредственное участие в возникновении и развитии клона лейкозных клеток.

В отличие от генетических повреждений, которыми, в частности, являются мутации, при эпигенетических нарушениях изменение структуры хроматина и транскрипционная инактивация генов возникает без изменения нуклеотидной последовательности ДНК [30, 35, 106, 128].

Следует отметить, что эпигенетические нарушения являются одной из причин изменения функции генов при ряде опухолевых заболеваний. Этот факт подчеркивает уникальную роль эпигенетических процессов в лейкозогенезе.

Однако независимо от причины, которая обусловливает аберрантную экспрессию генов: генетический или эпигенетический, возникающий эффект имеет одинаковые биологические последствия.

К основным эпигенетическим изменениям, влияющим на структуру хроматина, относят не только посттрансляционные модификации гистонов и экспрессию микроРНК, но и метилирование ДНК.

Отличительным признаком данных явлений является их обратимость, которая обусловливает возможность применения эффективного медикаментозного лечения с целью коррекции экспрессии генов, в частности генов-супрессоров опухоли.

Метилирование – обратимая модификация азотистого основания – цитозина, в результате которой происходит присоединение метильной группы к углероду, расположенному в 5-й позиции пиримидинового кольца. Донором метильной группы является S-аденозил-L-метионин, а катализатором реакции – ДНМТ.

Известно не менее трех вариантов ДНМТ, регулирующих метилирование в клетках (ДНМТ1, ДНМТ3а, ДНМТ3b), из которых ДНМТ3а и ДНМТ3b ответственны преимущественно за de novo метилирование [82]. Метилированию подвергается цитозин, предшествующий гуанину в так называемых CpG динуклеотидах. Динуклеотиды могут быть сконцентрированы в небольших по протяженности участках, для обозначения которых используется термин «островки CpG».

Обычно протяженность CpG островков составляет от 200 п.о. до 5 т.п.о.

Сосредоточены эти островки в основном в регуляторных (преимущественно промотерных) областях генов и встречаются в среднем через каждые 100 т.п.о.

[35].

Фенотипически метилирование проявляется в подавлении экспрессии определенных групп генов и связано с такими явлениями, как геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы и регуляция экспрессии генов.

Биологическое значение метилирования обусловлено феноменом транскрипционной инактивации, приводящей к аберрантной экспрессии генов-ов опухоли. Инактивация генов вследствие метилирования возможна при: 1) локализации данного эпигенетического феномена внутри и/или вокруг промотерной области гена и 2) взаимодействии метилированных участков ДНК с регуляторными белками с формированием участков плотного хроматина.

Метилирование островков CpG промотерных областей генов сопровождается изменением организации хроматина и степени его компактизации. Это, в свою очередь, влияет на участие в биологических процессах белков, активирующих транскрипцию генов, и выполнение этими белками роли активаторов генов.

Другой эпигенетический механизм регуляции организации хроматина – посттрансляционные модификации аминокислотных остатков выступающих «хвостов» гистонов (белков, необходимых для сборки и упаковки молекулы ДНК). При нормальной транскрипции генов гистоновые «хвосты»

ацетилированы, а в случае гиперметилирования (увеличения числа метилированных CpG островков) и инактивациии генов находятся в деацетилированном состоянии. Деацетилирование гистоновых «хвостов»

поддерживается гистондеацетилазами (HDACs), функциональная активность которых зависит от ДНМТ и метилцитозинсвязывающих протеинов хроматина.

Из двух эпигенетических механизмов, провоцирующих аберрантную экспрессию генов, а именно метилирования и деацетилирования, доминирующим в лейкозных клетках является метилирование. Именно этим объясняется тот факт, что при подавлении HDACs реэкспрессия генов возможна только в клетках нелейкозной природы, в которых не зафиксировано метилирование промотерных областей. Напротив, добавление ингибиторов HDACs к ранее назначенным гипометилирующим препаратам приводит к биологическому синергизму с высокой вероятностью реэкспрессии генов в лейкозных клетках и увеличению частоты клинического ответа.

Метилирование ДНК не является случайным биологическим процессом. Оно может быть обнаружено во многих генах одновременно [37]. Частота и степень метилирования промотерных областей отдельных генов различается среди больных с разным морфологическим и цитогенетическим фенотипом ОМЛ и МДС (таблицы 1, 2) [12, 33, 37, 80, 93]. Это в совокупности с возрастом, стадией заболевания, видом проводимой терапии, составом панели изучаемых генов и особенностями метилирования [87] определяет отсутствие однотипного характера изменений, выявляемых при изучении метилирования отдельных генов (таблица 1).

Следует отметить, что в формировании биологической вариабельности вместе с гиперметилированием немаловажную роль играет и гипометилирование (снижение числа метилированных CpG островков) динуклеотидов CpG относительно исходного уровня метилирования [54, 87], а при анализе уровня метилирования рассматривают не только частоту метилирования, но и степень кластеризации метилированных CpG островков.

Таблица 1 – Метилирование генов у больных с заболеваниями крови [35]

–  –  –

Примечание. При каждом варианте заболевания указан % (частота) инактивации данного гена среди всех больных с заболеваниями системы крови.

В настоящее время при исследовании метилирования у больных ОМЛ и МДС анализируют ряд генов. В последнее время все активнее исследуется ген p15INK4b – ингибитор циклинзависимой киназы, контролирующий клеточный цикл, а именно переход из G1 фазу в S фазу. Его транскрипционная инактивация, согласно международным данным [12, 33, 84, 87, 123], происходит в 30–90 % случаев.

По данным M. Toyota с соавт., из 36 обследованных больных ОМЛ метилирование чаще всего обнаруживается в генах MYOD, SDC4, GRP37 и PITX2 у 47–64 % больных. Реже в генах CACNA1G, MINT1, MINT2, p16INK4а, THBS1, p15INK4b, PTC1A, PTC1B и MDR1 – у 6–36 % больных [87]. Вероятно, что гиперметилирование гена p15 провоцирует метилирование других генов [93], хотя данное утверждение до конца не изучено.

Метилирование, являясь составной и неотъемлемой частью лейкозогенеза, вероятно, участвует в формировании клинико-гематологического фенотипа миелоидных неоплазий. Этим объясняются попытки выявить связь гиперметилирования с отдельными клиническими характеристиками и гематологическими показателями [12, 87]. Так, в ряде работ было продемонстрировано, что метилирование гена р15 и гена – рецептора эстрогена встречается преимущественно у молодых больных de novo ОМЛ [12, 14, 62].

Вместе с тем, во многих исследованиях не было выявлено сопряженности степени метилирования с такими клиническими и гематологическими показателями, как возраст и пол больного, вариант ОМЛ по FAB, мутационный статус генов FLT3, NPM1, характер предшествующего лечения и длительность периода от инициации терапии до развития вторичного МДС или ОМЛ [14, 33, 37, 53].

Несмотря на отсутствие четких связей метилирования островков CpG в промотерных областях отдельных генов с клинико-гематологическими показателями, наибольший практический интерес представляют данные о прогностической роли статуса метилирования, который нередко превышает значение такого маркера, как количество бластных клеток в костном мозге [33].

–  –  –

Число генов, которое подвергается метилированию, возрастает с прогрессией МДС. В свою очередь, аберрантное метилирование ассоциировано с негативным прогнозом и риском трансформации в ОМЛ [33, 36, 52, 85, 93].

В настоящее время обратимость эпигенетических изменений вызывает пристальное внимание к метилированию ДНК и деацетилированию гистонов как перспективным мишеням медикаментозного воздействия. Поэтому своевременное выявление аберрантного метилирования у больных МДС и ОМЛ в дебюте заболевания позволит прогнозировать течение заболевания и решить вопрос о назначении таргентной терапии.

1.2. Децитабин и 5-азацитидин в лечении больных ОМЛ и МДС

В настоящее время для лечения миелодиспластического синдрома и острого миелоидного лейкоза помимо курсов ПХТ применяют и гипометилирующие препараты.

На сегодняшний день зарегистрированы два гипометилирующих (эпигенетических) препарата: 5-азацитидин (5-Аза) (Вайдаза, “Селджен Холдингз Корпорэйшн”, Швейцария) и децитабин (Дакоген, “Janssen Pharmaceutica”, Бельгия). Они обладают гипометилирующим свойством, что имеет принципиальное значение, так как в лейкозных клетках доминирует метилирование островков CpG промотерных областей генов-супрессоров опухоли.

Статус метилирования ДНК имеет большое значение для контроля над транскрипцией генов. Если гиперметилирование островков CpG приводит к подавлению экспрессии генов, то гипо- и неметилированное состояния ассоциированы с активной транскрипцией генов [6, 72]. Непосредственная роль метилирования в патогенезе ОМЛ и МДС, а также заболеваемость МДС преимущественно среди лиц пожилого возраста [58, 122] в сочетании с приемлемым профилем токсичности азануклеозидов, объясняет широкое применение 5-Аза и децитабина в лечении больных миелоидными неоплазиями.

5-Аза способен встраиваться не только в ДНК, но и в РНК опухолевых клеток.

В свою очередь, децитабин связывается только с ДНК и способен оказывать как гипометилирующее, так и цитостатическое действие.

Гипометилирующий эффект этих двух препаратов опосредован формированием необратимых связей с ДНК-метилтрансферазой (ДНМТ).

Отсутствие фермента при последующем синтезе ДНК обусловливает неметилированное состояние цитозиновых остатков в дочерних ДНК и приводит к реэкспрессии генов с нормализацией процессов дифференцировки, физиологического старения и апоптоза лейкозных клеток [69].

Для успешной инициации процессов гипометилирования в лейкозных клетках необходимо длительное, в течение нескольких циклов репликации, воздействие 5-аза и децитабина на ДНК. Напротив, отмена азануклеозидов приводит к восстановлению статуса метилирования, инактивации генов и тем самым снижению клинического ответа.

5-Аза [4-амино-1--D-рибофуранозил-1,3,5-триазин-2(1Н)-один] – аналог нуклеозида с молекулярной массой 244,205 г/моль, в котором углерод в положении 5 заменен на азот. 5-Аза был впервые синтезирован как цитостатический препарат в Чехословакии в 1960 г. и проходил клиническую апробацию в США в 1970 г.

Известно, что 5-аза поступает в клетку с помощью нуклеозидных транспортеров hENT1 и hENT2. В отличие от децитабина, для фосфорилирования которого необходима дезоксицитидинкиназа, метаболизм 5-Аза зависит от активности уридин-цитидинкиназы. Это объясняет различие в механизмах резистентности и, как следствие, в случае клинической неэффективности одного препарата возможность смены на другой. Приблизительно 35–65 % 5-Аза встраивается в РНК. Оставшаяся часть под действием фермента рибонуклеотидредуктазы метаболизируется в 5-аза-2'-дезоксицитидин, который встраивается в ДНК. Препарат быстро выводится из организма в форме 5-азауридина через почки [110].

В России 5-Аза был зарегистрирован в 2010 г. для лечения больных МДС промежуточного-2 и высокого риска по Международной шкале прогноза IPSS (International Prognostic Scoring System), ОМЛ и ХММЛ (хронического миеломоноцитарного лейкоза).

К настоящему времени опубликованы результаты двух проспективных рандомизированных клинических исследований, CALGB 9221 и AZA-001, которые показывают нам превосходство 5-Аза над терапией поддержки и малыми дозами цитарабина у больных ОМЛ и МДС высокого риска [56, 111].

Основные результаты исследования CALGB 9221 можно сформулировать следующим образом. Во-первых, терапия 5-Аза улучшает показатели периферической крови у статистически значимого числа больных. При этом увеличивается не только количество больных, независимых от трансфузий, но и частота случаев снижения бластов (до менее 5 %) в миелограмме. Во-вторых, 5-Аза статистически значимо улучшает бессобытийную выживаемость за счет более чем двукратного уменьшения случаев трансформации в ОМЛ [111].

В отличие от CALGB 9221 в исследование AZA-001 были включены преимущественно больные промежуточного-2 и высокого риска по IPSS с диагнозами рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ), РАИБ-Т и ХММЛ [56].

Итогом клинического исследования AZA-001 является увеличение общей выживаемости больных МДС высокого риска при лечении 5-Аза. Назначение 5-Аза приводило к удлинению медианы выживаемости до 24,5 мес. в сравнении с 15 мес. при стандартной терапии (11,5 мес. на поддерживающей терапии, 15,3 мес. на малых дозах цитарабина и 15,7 мес. на стандартной химиотерапии).

Рассматривая улучшение выживаемости как цель терапии 5-Аза, следует отметить, что она ассоциирована с наступлением гематологического улучшения [17, 45, 101, 102]. В свою очередь, ответ на 5-Аза зависит от длительности терапии. Первые признаки гематологического улучшения можно зафиксировать уже после 2-го цикла терапии. У 52 % больных качество ответа в дальнейшем не меняется, но у остальных 48 % наилучший ответ, включая полную и частичную ремиссию, можно ожидать при продолжении терапии, вплоть до 12-го цикла [45].

Отсроченное развитие ответа обусловлено временем, которое необходимо для инкорпорации 5-Аза в ДНК и РНК и реэкспрессии генов-супрессоров опухоли [41, 72]. Предполагается, что в случае раннего ответа наблюдается низкий уровень метилирования и, как следствие, повышенная чувствительность бластных клеток к 5-Аза.

Децитабин – 4-амино-1-(2-дезокси--D-эритро-пентофуранозил)-1,3,5-триазинН)-он – структурный аналог нуклеозида цитозина, содержащий в 5 позиции пиримидинового кольца атом азота вместо атома углерода.

После поступления в клетку децитабин под действием фермента деоксицитидинкиназы конвертируется в 5-аза-2'-деоксицитидин-5'-монофосфат.

При последующем фосфорилировании образуется трифосфат децитабина, который встраивается в структуру ДНК в период S-фазы клеточного цикла.

Возникающая при этом необратимая ковалентная связь с ДНМТ (отсюда и более точное определение децитабина и 5-аза как «ингибиторов ДНК-метилтрансфераз»

или «азануклеозидов») приводит к восстановлению транскрипционной активности генов, инактивированных вследствие нормального или аберратного метилирования [51, 97]. Для децитабина характерны быстрая элиминация и отсутствие накопления в организме, стабильность фармакокинетических параметров при повторных введениях [119].

Проблема выбора одного из двух гипометилирующих препаратов – 5-Аза или децитабина – для практического применения затруднена из-за отсутствия сравнительных исследований. В этом случае целесообразно воспользоваться результатами двух метаанализов [48, 57, 71, 140]. Несмотря на анализ данных одних и тех же публикаций, использование разных статистических методик сопровождалось расхождениями в оценке отдельных параметров. Вместе с тем, заключение по такому принципиальному показателю, как общая выживаемость, было единодушным: 5-Аза эффективнее, чем децитабин [57, 140]. Вероятно, преимущества 5-Аза перед децитабином по показателю выживаемости связаны с тем, что 5-Аза встраивается одновременно как в ДНК, так и РНК, что позволяет воздействовать на клетки независимо от клеточного цикла. Важную роль также может играть большее количество генов, подвергающихся гипометилированию под воздействием 5-Аза [41, 52, 56, 69,111].

Предполагается, что низкий статус метилирования ДНК ассоциирован с высокой чувствительностью лейкозных клеток к 5-Аза и, как следствие, более высокой эффективностью терапии. Напротив, высокий уровень метилирования снижает вероятность ответа на азануклеозиды [31, 69].

1.3. Комбинированная терапия низкой интенсивности для лечения больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС Лечение больных рецидивами (особенно раннего, развивающегося через 6–12 мес. после констатации первой ПР) и резистентным ОМЛ (уровень костномозговых бластных клеток более 5 % после 1-2 интенсивных курсов ИР) – одна из трудноразрешимых проблем онкогематологии. Первичные резистентные варианты диагностируются у 10–40 % больных ОМЛ. Рецидивы констатируются у 40–60 % больных ОМЛ [50, 61, 79]. При выборе лечебного пособия данной категории больных необходимо принимать во внимание большое число показателей: возраст, общесоматический статус, коморбидность, характер повреждения кариотипа, мутационный профиль генов, предшествующая терапия, выбор больного (родственников).

Актуальность проблемы лечения рецидивов и резистентных вариантов ОМЛ обусловлена отсутствием унифицированного стандарта терапии. В частности, это связано с трудностями в прогнозировании резистентности к стандартным курсам ИР. Несмотря на значение таких показателей, как возраст, общий статус, количество лейкоцитов, характер заболевания (de novo или вторичный), вариант хромосомных аберраций и мутационный статус генов FLT3 и NPM1 [117], спрогнозировать неэффективность стандартных курсов ИР по предложенным факторам представляется практически невозможным [74]. Более информативным может быть обнаружение моносомного кариотипа, хромосомной аберрации inv(3)/t(3;3) или аберрации гена ТР53 [121].

В настоящее время предложено несколько шкал, позволяющих спрогнозировать дальнейшую эффективность лечения больных рецидивом и резистентным ОМЛ (таблицы 3, 4) [19, 105, 129].

–  –  –

Примечание. Благоприятный прогноз: 0 баллов; 2-летняя ОВ и БСВ 58 и 45 %. Промежуточный прогноз: 1 балл; 2-летняя ОВ и БСВ 37 и 31 %. Неблагоприятный прогноз: 2–3 балла; 2-летняя ОВ и БСВ 12 и 12 %.

–  –  –

варианты терапии низкой интенсивности могут рассматриваться как “bridge to transplantation” (переход) к АллоТГСК.

Другое перспективное направление в преодолении резистентности лейкозных клеток без усиления токсических осложнений – комбинация азануклеозидов с разными препаратами, включая ХП: полностью ретиноевая кислота, Ара-Ц, идарубицин, даунорубицин, акларубицин, талидомид, гомогаррингтон.

Обоснованием данного подхода являются результаты in vitro, при выполнении которых установлен синергизм, например, Дако с идарубицином [124] и Ара-Ц [125]. Подтверждением жизнеспособности данного подхода являются и первые сообщения о клинической эффективности комбинаций азануклеозидов с ХП [63, 96, 114]. Так, G. Borthakur с соавт. [114] приводят результаты одновременного назначения 5-азацитидина и цитарабина. Доза 5-азацитидина варьирует от 37,5 до 75 мг/м2 и вводится внутривенно однократно в течение последовательных 7 дней.

Цитарабин назначается по 100 мг/м2 в виде внутривенной суточной инфузии в течение 7 дней или по 1 г/м2 в виде внутривенной суточной инфузии в течение 4 или 3 дней (последняя доза использована у больных 65 лет и старше). Полная ремиссия была констатирована у 2 из 34 больных, один из которых имел комплексный кариотип, а другой – мутацию FLT3-ITD. Необходимо отметить крайне неблагоприятный прогноз у больных в данном исследовании: 94 % имели рецидив или резистентный вариант. При этом случаев негематологической токсичности 4 степени зафиксировано не было. Возможен и другой дизайн комбинированной терапии, предполагающий последовательное введение препаратов. U. Krug с соавт. [63] ранее не леченным больным ОМЛ в возрасте 61 года перед стандартным индукционным курсом 7+3 в течение 5 дней вводили 5-азацитидин по 37,5 или 75 мг/м2. B. Ding [96] для лечения 11 больных неблагоприятными вариантами ОМЛ использовали Дако по 20 мг/м2 внутривенно в течение 1–3 дней с последующим введением акларубицина 10 мг внутривенно в 4–10 дни и Ара-Ц 25 мг подкожно дважды в день на 4–13 дни с одновременным назначением Г-КСФ. У 8 больных (72,7 %) была достигнута ПР.

Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о том, что проблема лечения больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС, к которым относятся больные рецидивом и резистентным вариантом ОМЛ и больные МДС с избыточным количеством костно-мозговых бластов, остается попрежнему актуальной ввиду большого числа нерешенных вопросов. В связи с этим особую значимость приобретает решение задач по разработке новых схем терапии, особенно для лиц с отягощенным соматическим статусом и коморбидностью, а также выделение групп больных, которым, по результатам изучения особенностей биологического фенотипа лейкозных клеток, обоснованным представляется интенсификация лечебного пособия как в дебюте заболевания, так и по ходу проводимой терапии.

–  –  –

В работе использованы результаты обследования, лечения и наблюдения 166 больных, из которых 87 больных ОМЛ, 72 МДС и 7 ХМПН.

Обследование и лечение инициировалось после подписания больными информированного согласия.

Вторичный МДС, как результат ранее проведенной ХТ и/или лучевой терапии, имел место у 4 больных МДС и 5 ОМЛ.

Для решения поставленной цели и сформулированных задач было проведены следующие клинические и лабораторные исследования.

В исследовании по изучению клинической эффективности схемы “малые дозы Ара-Ц с кладрибином” было включено 10 больных: 9 ОМЛ и 1 МДС с избытком бластов. При этом у 2 больных ОМЛ был результатом трансформации предшествующего МДС или ХМПН.

Для изучения эффективности Дако был проведен ретроспективный анализ историй болезни и карт амбулаторного наблюдения 27 больных, включая 14 больных МДС, 6 ОМЛ и 7 ХМПН.

Ретроспективная оценка результатов лечения 5-Аза была проведена по данным обследования и наблюдения 13 больных МДС, включая 1 вторичным МДС, и 14 больных ОМЛ.

Для анализа влияния моносомного кариотипа на течение заболевания были проанализированы данные 76 больных, из которых 43 ОМЛ и 33 МДС. В данной группе вторичный ОМЛ и вторичный МДС имели место у 5 и 3 больных соответственно.

Статус метилирования р15INK4B и SOX7 был изучен в образцах ДНК 20 больных МДС и 17 больных ОМЛ.

Для изучения статуса метилирования 5 генов (р15INK4B, SOX7 и антагонистов сигнального пути Wnt были использованы образцы ДНК 46 больных МДС и 57 больных ОМЛ.

Распределение больных по нозологическим вариантам и виду проведенного исследования представлено в таблице 5.

Таблица 5 – Распределение больных по нозологическим вариантам и виду исследования

–  –  –

Исследования и анализ результатов, а также оформление данных в виде публикаций и отправка их в печать, были выполнены в период, включая первый квартал 2016 года. В связи с этим, а также учитывая отсутствие принципиальных различий в модификациях классификации ВОЗ за 2008 и 2016 гг., которые могли бы существенно повлиять на данные исследований, в диссертационной работе оставлена терминология, принятая в классификации ВОЗ 2008 г.

Диагностику миелоидных неоплазий осуществляли согласно классификации ВОЗ 2008 года, то есть разграничительный уровень бластных клеток в КМ между МДС и ОМЛ был 20 %.

Диагностика основывалась на результатах комплексного обследования, включая, прежде всего, анализ морфологических препаратов ПК и КМ с дифференцированным подсчетом не менее 200 клеток в мазках ПК и 500 клеток в мазках КМ.

Миелоидную и моноцитарную природу бластных клеток устанавливали по результатам окраски на миелопероксидазу, хлорацетатэстеразу, кислую фосфатазу, неспецифическую эстеразу, не ингибируемую фторидом натрия, а также липиды и полисахариды.

Для иммунофенотипирования бластных клеток была использована панель моноклональных антител, включающая в обязательном порядке антитела к cyMPO, cyTdT, CD33, CD13, CD14, CD34 и HLA-DR.

В случае первичной диагностики МДС обязательным элементом обследования больных было проведение трепанобиопсии с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованием. Последний вид исследования проводился при затруднениях в диагностике с использованием стандартных морфологических и гистологических методов.

Изучение кариотипа проводили в стандартном GTG-методе. Анализировалось не менее 20 метафаз.

Изучение мутационного статуса генов осуществляли методом ПЦР тотальной геномной ДНК.

Статус метилирования генов изучали посредством метилспецифической полимеразной цепной реакции (methylation-specific PCR, MSP).

На рисунке 2 представлены образцы изучения статуса метилирования генов р15INK4B и SOX7.

Рисунок 2 – Метилирование островков CpG промоторных областей гена p15INK4B (слева) и SOX7 (справа) На рисунке 2 обозначены: линия H – амплификат, полученный с праймерами для неметилированных участков ДНК; линия М – амплификат, полученный с праймерами для метилированных участков ДНК; 1 – результаты MSP у больного 1; 2 – результаты MSP у больного 2; 1 – результаты MSP у донора;

4 – результаты MSP с необработанной ДНК (не прошедшей бисульфатную конверсию).

2.3. Верификация прогноза, моносомного кариотипа и критерии оценки эффективности терапии Вариант прогноза у больных МДС устанавливали по шкалам IPSS и IPSS-R, что зависело от времени проведения исследования.

Прогностический вариант рецидива ОМЛ устанавливали согласно рекомендациям Breems D. с соавт. [105].

Моносомный кариотип верифицировали по критериям, впервые описанным Breems с соавт. [21]: комбинация 2-х аутосомных моносомий или комбинация одной аутосомной моносомии (за исключением изолированной потери Х или Y хромосомы) с 1 структурными аберрациями.

Эффективность терапии больных ОМЛ оценивали по критериям IWG 2003 г.

[79]. Для оценки эффективности лечения больных МДС были использованы критерии IWG 2006 г.

2.4. Схемы терапии гипометилирующими препаратами

Схема назначения Дако.

Практически все больные, за исключением одного, получали 5-дневную схему, которая подразумевает внутривенное введение Дако 20 мг/м2 в течение 1 часа однократно в сутки в течение пяти последовательных дней. Суммарная доза Дако на курс по данной схеме составляет 100 мг/м2. Курс планировался каждые 28 дней.

Один больной получал 3-дневную схему, согласно которой Дако вводится внутривенно 3 раза в сутки (то есть каждые 8 часов) по 15 мг/м2 в течение трех последовательных дней. Суммарная доза 135 мг/м2. Курс также планировался каждые 28 дней, начиная с первого дня.

Схема назначения 5-Аза.

Препарат вводился по 75 мг/м2 подкожно однократно в сутки в течение 7 последовательных дней. Длительность курса 28 дней.

Терапия Дако и 5-Аза проводилась на фоне сопроводительной терапии, основные элементы которой были следующие. Прием аллопуринола 300–600 мг/день, первые 2–3 курса. Прием фторхинолона (ципрофлоксацин 0,5 грамма два раза в день), первые 2–3 курса. Прием флуканазола, первые 2–3 курса.

Антиэметики перед каждым введением. Коррекция анемии трансфузиями донорских эритроцитов для поддержания уровня гемоглобина на уровне 80–85 г/л и 90–110 г/л у лиц старше 65 лет с сопутствующей сердечной коморбидностью.

Эритропоэзстимулирующие препараты. Трансфузии тромбоконцентрата при геморрагическом синдроме или уровне тромбоцитов 10109/л. Назначение Г-КСФ при развитии фебрильной нейтропении, прогнозировании длительной и глубокой нейтропении. Доза препаратов и длительность межкурсового интервала модифицировались по показателям ПК и клеточности КМ. Максимально возможное соблюдение рекомендуемых доз и длительности межкурсового интервала на первых курсах терапии.

2.5. Методы статистической обработки

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Excel Microsoft и STATISTICA 10.0.

Анализ ОВ и БРВ выживаемости проводили с использованием метода Каплана-Майера. В качестве точки отсчета для вычисления ОВ было выбрано время диагностики ОМЛ или МДС. Показатели БРВ рассчитывали от даты констатации ПР.

Статистически достоверными считали различия при значимости р0,05.

Для решения поставленной цели работа была выполнена в два этапа.

На первом этапе было запланировано изучение клинической эффективности оригинальной схемы лечения больных рецидивом и резистентным ОМЛ “малые дозы Ара-Ц с кладрибином” и гипометилирующих препаратов: Дако и 5-Аза.

На втором – ретроспективный анализ результатов лечения больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом и данных изучения статуса метилирования генов p15INK4B, SOX7 и антагонистов сигнального пути Wnt для определения перспективных путей повышения эффективности лечения больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС.

–  –  –

На основании данных литературы и многолетнего опыта, накопленного в клиническом отделе Гематология ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России, а также учитывая настоятельную практическую потребность, была разработана схема для лечения больных рецидивами и резистентным ОМЛ, которым по разным причинам не представляется возможным проведение стандартной ХТ или ВДХТ.

Основу схемы составляют широко используемые в гематологической практике малые дозы Ара-Ц, усиленные дополнительным назначением кладрибина. Дозы, сроки назначения и пути введения препаратов были следующими.

Цитарабин по 10–15 мг/м2 подкожно 2 раза в день в течение 1–14 последовательных дней.

Кладрибин по 5 мг/м2 внутривенно в виде 2-часовой инфузии в течение 1–5 дней.

Повторный курс планировался в случае снижения содержания бластных клеток в контрольной миелограмме не менее чем на 50 % по сравнению с исходным уровнем.

3.2. Характеристика больных

После подписания информированного согласия в исследование было включено 10 больных в возрасте 26–58 лет, медиана 48 лет.

Распределение по нозологическим вариантам: 7 больных ОМЛ de novo, 1 ОМЛ с МД (трансформация из предшествующего МДС), 1 РАИБ-2 и 1 больной с лейкозной трансформацией предшествующего ХМПН.

Первично-резистентный ОМЛ был диагностирован у четырех больных.

Рецидив ОМЛ имел место у трех больных: у 2 – ранний и у 1 – поздний.

Стандартная противорецидивная терапия 7 больных ОМЛ de novo была неэффективной.

Больной РАИБ-2 не ответил на индукционную терапию 7+3, а ВДХТ не назначалась из-за тяжелых инфекционных осложнений.

Многочисленные курсы ХТ получали больные ОМЛ с МД и с лейкозной трансформацией ХМПН до включения в исследование.

Нормальный кариотип выявлен у 5 больных. При этом у одной больной при FISH исследовании был обнаружен химерный ген RUNX1-RUNX1T1, соответствующий транслокации t(8;21). У двух больных обнаружена одиночная хромосомная аберрация в виде делеции длинного плеча 9 хромосомы. Сочетанное повреждение 2 хромосом имело место у 1 больной. У двух больных выявлен комплексный кариотип, соответствующий критериям моносомного. При этом в одном случае множественные хромосомные аберрации были обнаружены при рецидиве, тогда как в предшествующий период кариотип был нормальный.

Мутации обнаружены у 2 больных: мутация FLT3-ITD у больной ОМЛ с МД и мутация c-KIT у больной ОМЛ, у которой методом FISH был выявлен химерный ген RUNX1-RUNX1T1.

По статусу ECOG распределение больных было следующим: 1 степень – 1 больной, 2 степень – 6 больных и 3 степень – 3 больных.

Перед началом первого курса в анализе ПК концентрация гемоглобина варьировала от 65 до 120 г/л (медиана 85 г/л), содержание лейкоцитов от 1,3 до 42,0109/л (медиана 3,0109/л) и тромбоцитов от 3 до 290109/л (медиана 99109л).

Количество проведенных курсов комбинированной терапии было от 1 до 2, что соответствовало условиям клинической апробации схемы “малые дозы Ара-Ц с кладрибином“.

3.3. Результаты исследования

Во всех случаях доза и длительность введения кладрибина соответствовали утвержденной схеме.

Сроки введения Ара-Ц были соблюдены только у 2 больных. Одному из больных с первично-резистентным вариантом ОМЛ инъекции Ара-Ц были продолжены до 21 дня включительно по причине персистирующей бластемии и относительно благоприятного соматического статуса. Длительность повторного курса у этого больного составила 14 дней. У остальных 7 больных сроки введения Ара-Ц были редуцированы до 7–12 дней из-за тяжелых инфекционных осложнений, развившихся на фоне нейтропении 3–4 степени и/или неблагополучного соматического статуса.

Эффективность терапии была следующей.

После первого курса ПР была зафиксирована у 2 больных, у одного из которых одновременно была констатирована и ЦР. У 3 больных была достигнута ЧР.

Ответа на терапию не было у 5 больных. У одного больного, несмотря на неэффективность проведенного курса, отмечена стабилизация уровня бластных клеток в костно-мозговом пунктате.

Отдельные клинико-гематологические характеристики больных, ответивших на комбинированную терапию, представлены в таблице 6.

Следует отметить следующие данные. Гематологический эффект был зафиксирован у больных ОМЛ de novo с миелоидной и моноцитарной природой бластных клеток. Ответ был констатирован как при рецидиве болезни, так и резистентном варианте ОМЛ, независимо от варианта кариотипа, включая комплексный. У больных снижение объема лейкозных клеток сопровождалось улучшением соматического статуса, что позволило рассматривать их в качестве потенциальных кандидатов на АллоТГСК. Трем больным была выполнена АллоТГСК. Длительность курса была от 10 до 21 дня у больных с ПР и 7–14 дней у больных с ЧР.

Таблица 6 – Клинико-гематологическая характеристика больных с ответом

–  –  –

Примечания: 1 – статус перед первым и вторым курсом соответственно. 2 – длительность 1 и 2 курса соответственно.

– 46,ХУ,del(6)(21),del(7)(q22),del(9)(q21),inv(11)(q13q23),-14,-18,der(19),t(19;?)(q13;?).

Наряду с данными, представленными в таблице 6, необходимо указать на тот факт, что ни в одном случае не было выявлено мутаций генов FLT3, NPM1 и cKIT. У больного с множественными хромосомными аберрациями на момент инициации режима кондиционирования, то есть через 2 мес. после достижения ПР, было установлено прогрессирование заболевания с нарастанием уровня бластных клеток в пунктате КМ. Одному больному в связи с улучшением соматического статуса и значительным снижением объема лейкозных клеток в период поиска HLA-совместимого донора была инициирована терапия 5-Аза.

После завершения первого курса во всех случаях было зарегистрировано снижение показателей ПК. Нейтропения и тромбоцитопения 3–4 степени были зафиксированы практически у всех больных: у 10 и 9 соответственно.

Фебрильная нейтропения имела место у 2 больных. В одном случае диагностирована пневмония. Сепсис, вызванный эпидермальным стафилококком, был верифицирован у одного больного. Кроме того, в единичных наблюдениях имели место гипоальбуминемия, сиалоаденит, ассоциированный с цитомегаловирусной инфекцией, обострение хронического гастрита, мукозит, токсический гепатит, энтеропатия. Перечисленные осложнения были умеренной степени тяжести.

Необходимость в трансфузиях донорских эритроцитов и тромбоконцентрата была у 10 и 9 больных соответственно, то есть в 100 и 90 % случаев.

В течение первых 8 недель лечения не было зарегистрировано ни одного случая смерти.

–  –  –

В качестве первой линии терапии децитабин был назначен 13 больным:

8 МДС, 2 ОМЛ и 3 ХМПН. Выбор децитабина для лечения больных ОМЛ был обусловлен двумя причинами: это возраст и кардиальная коморбидность.

Показания у других 14 больных были следующие. Трансформация МДС в ОМЛ или прогрессия ХМПН с нарастанием уровня бластных клеток на фоне ХТ (6 больных). Неэффективность или резистентность ранее проведенной ХТ (7 больных). Тяжелые токсические осложнения от стандартной ХТ (1 больной) (таблица 8).

–  –  –

Общее количество проведенных курсов варьировало от 1 до 16, медиана 6.

Из 6 больных ОМЛ только 1 получил 3 курса. В остальных случаях терапия была прекращена после первого курса по причине развития инфаркта миокарда (1 больной) или нарастания процента бластных клеток в ПК и КМ (4 больных).

Децитабин в дозе 135 мг/м2/курс был назначен больному резистентной формой ОМЛ. В остальных случаях была применена схема с курсовой дозой 100 мг/м2 (см.

п. 2.4).

–  –  –

Общий ответ получен у 13 больных (48,1 %).

Вариантами ответа были ПР, к/мР и стабилизация со снижением потребности в трансфузиях донорских эритроцитов соответственно у 2 (7,4 %), 3 (11,1 %) и

–  –  –

У остальных 8 больных сохранялся достигнутый эффект в течение 3–36 мес.

У больного ХМЛ после первого курса было констатировано значительное сокращение размеров печени и селезенки, отсутствие в клиническом анализе ПК бластных клеток и переходных форм нейтрофилов, снижение потребности в трансфузиях донорских эритроцитов. Одному больному МДС, РАИБ-2 была выполнена АллоТГСК от HLA-совместимого родственного донора.

Медиана ОВ больных, ответивших на лечение, составила 12,8 мес.

Для определения факторов, ассоциированных с эффективностью Дако, были проанализированы такие показатели, как возраст, вариант заболевания, кариотип и линия терапии.

По данным проведенного анализа были выявлены следующие два принципиальных фактора, оказывающих разной степени значимости влияние на ОВ. Это – вариант кариотипа и вариант заболевания.

Медиана ОВ больных в группах с нормальным, другим и комплексным кариотипом была 9,8, 8,0 и 2,0 мес. соответственно; р=0,044 (рисунок 3).

Значимость различия обеспечивалась преимущественно за счет наихудших показателей, имевших место у больных с множественными хромосомными аберрациями: нормальный + другой кариотип против комплексного; р=0,019.

Медиана ОВ больных в группах, сформированных по нозологическому варианту, а именно в группах ХМПН, МДС и ОМЛ была 11,2, 5,9 и 4,5 мес.

соответственно; р=0,051 (рисунок 4).

Различие имело пограничное значение. При этом наихудшие показатели установлены у больных из группы ОМЛ по сравнению с больными двух других групп: р=0,049.

Рисунок 3 – Кариотип и общая выживаемость Рисунок 4 – Морфологический вариант и общая выживаемость

4.2. Эффективность 5-азацитидина и факторы, ассоциированные с ответом

–  –  –

Проанализированы данные 27 больных в возрасте 39–84 лет, медиана 72 года.

Больных 65 лет и старше было 25 (92,6 %). У 13 больных диагностирован МДС и у 14 ОМЛ. Отдельные данные обследования больных представлены в таблице 10.

–  –  –

В группе МДС у всех больных уровень бластных клеток в КМ был 5 %. При этом у 3 больных верифицирован РАИБ-1 и у 10 РАИБ-2. Период от диагностики заболевания до назначения 5-Аза варьировал от 1 до 48 мес. Ранее никто из больных МДС не получал ХТ или гипометилирующие препараты.

Группу ОМЛ сформировали 13 больных М2 вариантом и 1 больной М4 вариантом. Период от диагностики ОМЛ или предшествующего заболевания (случаи с лейкозной трансформацией) до инициации терапии 5-Аза был 1–38 мес.

В течение этого времени 2 больных ХМПН получали сдерживающее лечение и 1 больной ОМЛ получал ХТ.

4.2.2. Результаты исследования

Число проведенных курсов варьировало от 2 до 25, медиана 8.

Полная ремиссия была достигнута у 6 больных (22,2 %), включая 4 больных ОМЛ и 2 больных МДС. Костно-мозговая ремиссия была констатирована у 1 больного МДС (3,7 %). Эритроцитарный ответ, соответствующий критериям ГУ-Эр, был зафиксирован у 11 больных (40,7 %), из которых 5 больных ОМЛ и 6 больных МДС.

Таким образом, общий ответ на терапию 5-Аза был получен у 18 из 27 больных, что составило 66,7 %.

Отдельные клинико-гематологические характеристики больных с ПР и к/мР были следующими. Возраст от 48 до 84 лет, медиана 66 лет. Длительность периода, предшествующего назначению 5-Аза, не превышала 4 мес., за исключением одного больного. Цитостатическую терапию до инициации лечения гипометилирующими препаратами получил 1 больной М4 вариантом ОМЛ: два индукционных курса «5+2» без эффекта. Достижение ПР потребовало проведения 4–7 курсов, а к/мР – не менее 6 курсов.

Клинические показатели больных, у которых терапия 5-Аза сопровождалась гематологическим улучшением, были следующие. Возраст от 41 до 81 года, медиана 61 год. Период от диагностики до назначения 5-Аза от 1 до 48 мес.

Уменьшение зависимости от трансфузий донорских эритроцитов или полный отказ от них был констатирован после 2–6 курсов.

При корреляционном анализе не выявлено ассоциации эффективности терапии с возрастом (моложе или старше 60 лет), видом заболевания (ОМЛ или МДС), длительностью предшествующего периода (меньше или больше 6 мес.), исходным уровнем гемоглобина (меньше или больше 90 г/л), лейкоцитов (меньше или больше 3109/л) и тромбоцитов (меньше или больше 50109/л), а также зависимостью от трансфузий донорских эритроцитов и тромбоконцентрата. Во всех случаях значение р было 0,05.

У 5 больных (83,3 %) ПР сохраняется в течение 1–12 мес.

Прогрессия констатирована у 2 больных: у одного больного ОМЛ через 2 мес. после диагностики ПР и у 1 больного РАИБ-2 с комплексным кариотипом через 13 мес. после достижения к/мР.

В группе с ГУ-Эр у 3 больных ОМЛ и 1 больного МДС через 2–19 мес. после достигнутого клинико-гематологического эффекта выявлено нарастающее ухудшение лабораторных показателей с увеличением уровня бластных клеток в миелограмме, расцененное как прогрессия. Проводимая терапия оказалась неэффективной. Во всех случаях наступил летальный исход.

У 9 больных (33,3 %) терапия была расценена как неэффективная. Так, у 4 больных ОМЛ и 3 больных МДС, несмотря на отсутствие нарастания количества бластных клеток в КМ, сохранялась потребность в регулярных трансфузиях донорских эритроцитов и тромбоконцентрата. У двух других больных при морфологическом мониторинге отмечено постепенное увеличение числа бластных клеток. Вместе с тем, следует отметить, что 4 из 7 больных со стабилизацией заболевания живы в течение 4–11 мес.

В большинстве случаев прогрессии ОМЛ и МДС больным назначались курсы малых доз Ара-Ц, которые были неэффективными во всех случаях.

При наблюдении за больными от 2 до 29 мес. медиана ОВ составила 11,5 мес.

(рисунок 5).

Для дальнейшего анализа больные были распределены в 2 группы по эффективности терапии. Группу с ответом сформировали больные с ПР, к/мР и ГУ-Эр (18 больных). Больные со стабилизацией и прогрессией составили вторую группу (9 больных). Медиана ОВ в группах составила 15,9 и 7,4 мес.

соответственно; р=0,010 (рисунок 6).

Рисунок 5 – Общая выживаемость больных, получавших 5-азацитидин Рисунок 6 – Общая выживаемость эффективность терапии 5-азацитидином Для интерпретации полученных данных была рассчитана отдельно медиана ОВ больных с ГУ-Эр и со стабилизацией. Показатели были следующими: 10,2 и 8 мес. соответственно.

Таким образом, результаты изучения клинической эффективности новой схемы “малые дозы Ара-Ц с кладрибином” и гипометилирующих препаратов дают основание пополнить список лечебных пособий, оказываемых больным неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС: с рецидивом и резистентным вариантом, а также с отягощенным соматическим статусом и неблагоприятной коморбидностью.

В то же время неблагоприятное влияние, оказываемое на эффективность терапии отдельных вариантов кариотипа, а также вероятность прогрессии миелоидных неоплазий даже в случае ответа на гипометилирующие препараты обосновывают необходимость дальнейшего совершенствования лечения. В связи с этим актуальным представляется оценка влияния моносомного кариотипа на течение ОМЛ и МДС при назначении стандартных методов ХТ. Другое перспективное направление – оптимизация терапии азануклеозидами посредством расширения показаний к их назначению и обоснования целесообразности интенсификации лечения.

–  –  –

Перед отбором был сформулирован критерий исключения из данного исследования, которым было обнаружение транслокации t(8;21) и t(15;17), а также инверсия 16 хромосомы независимо от количества и характера сопутствующих хромосомных аберраций.

Анализу подвергнуты данные 76 больных, включая 43 больных ОМЛ и 33 больных МДС (таблица 11).

–  –  –

Число моносомий у одного больного варьировало от 1 до 7.

При этом случаи с 3 и более моносомиями чаще обнаруживались у больных 60 лет: 44,4 против 18,8 % среди больных моложе 60 лет; р=0,087.

Наиболее часто выявлялись моносомия 7 и моносомия 5: у 12 (27,9 %) и 10 (23,2 %) больных соответственно.

Следующими по частоте были моносомия 3, 17 и 18, каждая из которых имела место у 9 больных (20,9 %). Важно отметить, что первые четыре из упомянутых аберраций были более частой находкой в группе больных старше 60 лет. У 35 больных (81,4 %) были выявлены множественные хромосомные аберрации.

Эффективность терапии и ОВ были оценены по данным наблюдения за 37 больными ОМЛ.

Общая выживаемость больных ОМЛ с моносомным кариотипом составила 6 мес. (рисунок 7).

1,0 0,9

–  –  –

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

–  –  –

Рисунок 7 – Общая выживаемость больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом Принимая во внимание ретроспективный характер исследования, необходимо отметить факт назначения больным разной по интенсивности цитостатической терапии. Так, 21 больному с медианой возраста 53 года лечение начинали с индукционных курсов 7+3. Большинство из них в дальнейшем получали ВДХТ.

В этой группе ПР была констатирована у 9 больных, из которых у 4 развился ранний рецидив. То есть резистентными к стандартной ХТ были 16 больных (76,2 %).

Другим 16 больным назначался один из вариантов терапии низкой интенсивности, включая малые дозы Ара-Ц и гипометилирующие препараты.

Медиана возраста этих больных составила 71 год. Ответа на терапию не было ни в одном случае (таблица 12).

Таблица 12 –Эффективность терапии 37 больных ОМЛ с моносомным кариотипом

–  –  –

В то же время у 6 из 37 больных (16,2 %) констатировано относительно благоприятное течение ОМЛ с длительностью безрецидивного периода от 10 до 170 мес. Эти больные получали стандартные индукционные и консолидирующие курсы ХТ, включая АллоТГСК (1 больная). Число хромосомных аберраций у них варьировало от 2 до 9. Ни в одном случае не было выявлено неслучайных хромосомных поломок, то есть повторяющихся от больного к больному. Ни в одном случае не было также обнаружено и аберраций с вовлечением региона 17р13, являющегося местом локализации гена-супрессора опухоли ТР53 (таблица 13).

–  –  –

Число моносомий у отдельного больного было от 1 до 4. Зависимости количества моносомий от возраста не установлено.

Наиболее частыми находками были моносомия 5 (10 больных, 30,3 %), 18 (7 больных, 21,2 %) и моносомия 7 (5 больных, 15,2 %). Не выявлено тенденции к более частому обнаружению отдельных моносомий у больных определенных возрастных групп.

Комплексный кариотип был верифицирован у 29 больных (87,9 %).

Для вычисления ОВ были использованы данные наблюдения за 24 больными.

Медиана ОВ составила 8 мес. и представлена на рисунке 7.

Больные МДС получали разные виды терапевтического пособия, выбор которого зависел от процентного содержания бластных клеток в миелограмме, тяжести цитопении, клеточности КМ, возраста и соматического статуса.

Стандартная комбинация Ара-Ц с антрациклинами в качестве первой линии терапии была назначена 6 больным. Терапию низкой интенсивности, включая Дако, малые дозы Ара-Ц и алкеран, получали 12 больных. Остальным 6 больным в качестве первой линии назначались иммуносупрессивные, эритропоэзстимулирующие и антицитокиновые препараты.

Терапия была эффективной только у 2 больных. В одном случае ПР была достигнута после первого курса Дако, а во втором – после индукционного курса 7+3 с введением митоксантрона. У обоих больных при стандартном цитогенетическом исследовании делеция 17р13 не выявлялась, но при этом имела место моносомия 17 хромосомы. Длительность ПР была кратковременной.

Более длительный период наблюдения отмечен у двух больных: 20 и 38 мес.

В обоих случаях имели место варианты МДС без избытка бластных клеток (таблица 14).

–  –  –

Изучение статуса метилирования было выполнено в два этапа.

На первом (пилотном) этапе были проанализированы данные о статусе метилирования генов р15INK4B и SOX7. Полученная в ходе выполнения этого исследования информация послужила основанием для расширения числа изучаемых генов. Поэтому на втором этапе список изучаемых генов был дополнен посредством включения в него антагонистов сигнального пути Wnt.

6.1. Статус метилирования генов р15INK4B и SOX7 (этап I)

–  –  –

До инициации исследования были сформулированы следующие критерии включения: МДС de novo, ОМЛ de novo, отсутствие в анамнезе указания на терапию гипометилирующими препаратами, ранее не леченные больные ОМЛ, наблюдение за больными после заготовки биологических образцов в течение не менее 6 мес., достаточное для исследования количество и качество образца ДНК.

Критерием исключения был острый промиелоцитарный лейкоз.

Согласно установленным критериям, были отобраны данные 37 больных, включая 20 МДС и 17 ОМЛ.

Характеристика больных МДС.

Возраст от 41 до 79 лет, медиана 63 года.

2 больных РА, 1 РАКС, 3 с изолированной делецией del(5q), 5 РЦМД и 9 больных РАИБ, включая 2 РАИБ-1 и 7 РАИБ-2.

Нормальный кариотип выявлен у 7 больных. Хромосомные аберрации обнаружены у 12 больных. Кариотип 1 больного на момент заготовки ПК был неизвестным из-за отсутствия роста клеток в культуре.

Характеристика больных ОМЛ.

Возраст от 34 до 75 лет, медиана 56,5 года.

Распределение по морфологическим вариантам было следующим: 3 больных М1 вариантом, 7 М2, 1 М4, 2 М5, 3 М6 и 1 больной М7 вариантом.

Цитогенетическое исследование выполнено у 16 больных. Нормальный кариотип был у 7 больных. Хромосомные поломки выявлены у 9 больных и представлены одиночными, двойными или множественными аберрациями.

6.1.2. Результаты исследования

Результаты исследования образцов ДНК больных МДС.

Метилирование генов обнаружено у 16 больных (80 %). Аберрантный статус генов р15INK4B и SOX7 выявлен у 5 (25 %) и 16 (80 %) больных соответственно. Во всех случаях метилирование гена р15INK4B сопровождалось аберрантным статусом гена SOX7. У 11 больных выявлено метилирование только гена SOX7.

При вариантах без избытка бластных клеток более частой находкой было метилирование гена SOX7 (63,6 %), нежели гена р15INK4B (18,2 %); р=0,030.

У больных РАИБ частота аберрантного статуса генов значительно возрастала, при этом метилирование гена SOX7 по-прежнему оставалось доминирующим событием – 100 и 33,3 % соответственно; р=0,002. Выявлена тенденция к сопряженности метилирования гена SOX7 с избыточным количеством бластных клеток в КМ: r=0,452; p=0,045.

Метилирование гена р15INK4B было более частой находкой у больных с нормальным нежели аберрантным кариотипом, хотя различие не было значимым: 42,9 против 8,3 %; р=0,075. Частота метилирования гена SOX7 была одинаково высокой независимо от варианта кариотипа: 71,4 и 83,3 % соответственно. При этом у больных с цитогенетическими поломками чаще обнаруживался аберрантный статус гена SOX7, чем гена р15INK4B: 83,3% против 8,3 %; р=0,002 (таблица 15).

–  –  –

Результаты исследования образцов ДНК больных ОМЛ.

Метилирование генов р15INK4B и SOX7 обнаружено у 8 из 17 (47,1 %) больных.

Частота аберрантного статуса гена SOX7 была выше, чем гена р15INK4B (47,1 против 11,8 %) и во всех случаях метилирование гена р15INK4B сопровождалось метилированием гена SOX7. Метилирование гена SOX7 с большей частотой выявлялось у больных миелоидными (М1 и М2) вариантами: 60 против 28,6 % больных с другими морфологическими вариантами; р=0,019.

Распределение случаев с аберрантным статусом генов р15INK4B и SOX7 среди больных с нормальным кариотипом и цитогенетическими поломками было практически одинаковым (см. таблицу 15).

При наблюдении за больным в сроки от 1 до 19 мес. (медиана 4 мес.) из 10 больных, у которых была достигнута ПР, рецидив развился у 5, включая 1 из 4 (25 %) больных без метилирования генов и 4 из 6 (66,7 %) больных с метилированием генов. Следует отметить, что у 2 из 4 больных с аберрантным статусом (метилирование гена SOX7) рецидив развился после АллоТГСК.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вариабельности статуса метилирования генов в зависимости от клинико-гематологических характеристик МДС и ОМЛ и негативном влиянии аберрантного статуса генов на течение миелоидных неоплазий. В то же время результаты пилотного исследования не позволяют обосновать целесообразность интенсификации терапии гипометилирующими препаратами в отдельных группах больных в случае неудачи монотерапии Дако или 5-аза. В связи с этим спектр изучаемых генов был расширен с 2 до 5 посредством включения в него антагонистов сигнального пути Wnt.

–  –  –

Характеристика больных.

Обследовано 46 больных в возрасте 24–88 лет (медиана 67,5 лет), включая 4 больных РА, 3 РАКС, 6 с изолированной del(5q), 10 РЦМД и 23 больных РАИБ, из которых 7 РАИБ-1 и 16 РАИБ-2.

Кариотип изучен у 44 больных: у 18 (40,9 %) выявлен нормальный кариотип, у 8 (18,2 %) изолированная del(5q), у 8 (18,2 %) комплексный кариотип и у 10 (22,7 %) больных другие варианты цитогенетических поломок.

Результаты исследования.

Метилирование одного и более генов обнаружено у 43 больных (93,5 %).

Встречаемость аберрантного метилирования была следующей: SOX7 у 39 больных (84, 8 %), SFRP1 у 33 (71,7 %), p15INK4b у 25 (54,3 %), SFRP4 у 13 (6,5 %) и SFRP5 у 13 больных (6,5 %). Таким образом, аберрантное метилирование в генах SOX7, SFRP1 и p15INK4b было более частой находкой, чем в генах SFRP4 и SFRP5 (таблица 16).

–  –  –

Учитывая незначительное число больных с отдельными вариантами МДС, для установления возможной прогностической значимости статуса метилирования генов были сформированы две группы в зависимости от процента бластных клеток в КМ: 5 % и 5 %. Число больных с аберрантным метилированием генов SFRP1, SFRP4, SOX7 и p15INK4b в указанных группах не различалось. В то же время, метилирование гена SFRP5 значимо чаще обнаруживалось у больных РАИБ, чем при других вариантах: 43,5 против 13,0 % соответственно; OR=5,1, 95 % CI: 1,2-22,3; p=0,047 (рисунок 8).

Для установления прогностической значимости числа метилированных генов дополнительно были выделены группы больных с 0-1 и 2-5 метилированными генами (таблица 17).

Независимо от морфологических вариантов, преимущественной находкой в обеих группах было метилирование 2 и более генов: у 73,9 % больных с 5 % бластов и у 91,3 % больных с 5 % бластов.

Следует отметить, что случаи с метилированием 0-1 генов в 3 раза чаще встречались в группе больных с благоприятными морфологическими вариантами, нежели у больных РАИБ, хотя различие было незначимым: 26,1 против 8,7 % соответственно (OR=3,7 95 % CI:

0,7-20,1; p=0,24) (таблица 17).

Гены Менее 5 % бластов в костном мозге 5 % и более бластов в костном мозге SOX7 SFRP1 p15INK4b SFRP4 SFRP5

–  –  –

Наряду с этим, обращает внимание тот факт, что у всех больных РАКС число генов с метилированием промоторных областей было 4, в отличие от больных другими благоприятными морфологическими вариантами, у которых аберрантное метилирование одновременно в 4 генах было представлено лишь единичными наблюдениями. Интерпретация данной находки невозможна из-за небольшого числа наблюдений. Что касается больных РАИБ, то нарастание бластоза сопровождалось тенденцией к увеличению случаев с 3-5 метилированными генами: 75,0 % больных РАИБ-2 против 28,5 % больных РАИБ-1; OR=7,5 95 % CI:1,0-55,2; p=0,066.

Не установлено ассоциации числа метилированных генов с возрастом больных, количеством бластных клеток (5 % против 5 %) и вариантом кариотипа.

Увеличение числа метилированных генов с 0-1 до 2-5 также не влияло на ОВ обследованных больных; р=0,433.

6.2.2. Статус метилирования генов р15INK4B, SOX7 и антагонистов сигнального пути у больных ОМЛ Характеристика больных.

Обследовано 57 больных в возрасте 20–79 лет, медиана 51 год. Распределение по вариантам: 2 больных М0 вариантом, 7 М1, 23 М2, 4 М4, 8 М5, 3 М6 и 10 больных ОМЛ с МД. 8 больных ОМЛ с МД имели в анамнезе указание на один из вариантов МДС.

Кариотип был изучен у 56 больных. По результатам цитогенетического исследования были сформированы три группы: 31 (54,4 %) больной с нормальным кариотипом, 8 (14,0 %) с комплексным кариотипом и 17 (29,8 %) с другими хромосомными аберрациями.

Результаты исследования.

Аберрантное метилирование 1 генов выявлено у 52 из 57 больных (91,2 %).

На рисунке 9 представлены данные о доле больных с аберрантным статусом метилирования отдельных генов.

Рисунок 9 – Доля больных ОМЛ с аберрантным статусом метилирования

Наиболее частой находкой было метилирование генов SFRP1 и p15INK4: у 39 (68,4 %) и 36 (63,2 %) больных соответственно. Следующими по частоте убывания были гены SOX7, SFRP4 и SFRP5: 27 (47,4 %), 24 (42,1 %) и 20 (35,1 %) больных соответственно. Метилирование 1 гена семейства SFRP выявлено у 48 больных (84,2 %).

При анализе распределения больных по числу метилированных генов установлено, что метилирование 1, 2, 3, 4 и 5 генов имело место у 8 (14,0 %), 17 (29,8 %), 12 (21,1 %), 7 (12,3 %) и 8 (14,0 %) больных соответственно. То есть наиболее частой находкой было аберрантное метилирование 2 или 3 генов одновременно. Значимого различия в распределении по числу генов с аберрантным метилированием между больными 60 и старше 60 лет не обнаружено.

При выделении групп по морфологическому варианту установлено, что половина всех случаев с метилированием 5 генов (4 из 8 больных) приходилась на группу ОМЛ с МД. Кроме того, среди больных ОМЛ с МД было больше наблюдений с одновременным метилированием 3-5 генов (7 из 10 больных, 70 %), чем при любом другом варианте (рисунок 10).

При анализе числа метилированных генов в группах с разными вариантами кариотипа выявлено, что у больных с нормальным кариотипом и больных с одной или двумя независимыми хромосомными аберрациями чаще обнаруживалось метилирование 2-х (32,3 и 29,4 % соответственно) и 3-х (22,6 и 23,5 % соответственно) генов одновременно. Напротив, метилирование 5 генов чаще выявлялось у больных с множественными хромосомными аберрациями (рисунок 11).

Отражением этого является значимое различие между долями больных с комплексным и нормальным кариотипом, у которых выявлено одновременное метилирование 5 генов: 50,0 против 9,7 % соответственно; OR=9,3, 95 % CI 1,5p=0,022. Еще более значимое различие по данному показателю наблюдалось при сравнении группы больных с комплексным кариотипом со всеми остальными пациентами: 50,0 против 8,3 % соответственно; OR=11,0, 95 % CI 2,0-61,6, p=0,01.

Морфологические варианты ОМЛ Гены М0 М1 М2 М4 М5 М6 ОМЛ с МД SOX7 p15INK4b SFRP1 SFRP4 SFRP5

–  –  –

При изучении влияния числа генов с аберрантным статусом метилирования (0-2 против 3-5) на выживаемость больных с нормальным кариотипом при проведении индукционной терапии 7+3 были проанализированы данные 23 больных без мутаций в генах FLT3 и NPM1.

В группе с 0-2 метилированными генами (13 больных) ПР была достигнута у 9 (69,2 %) больных. У 4 больных констатирован первично-резистентный вариант.

Рецидив развился у 5 больных. Медиана времени наблюдения составила 24 (7-64) мес.

В группе с 3-5 метилированными генами (10 больных) ПР диагностирована у 8 (80,0 %) больных, из которых у 4 в последующем развился рецидив. Период наблюдения варьировал от 2 до 96 мес., медиана 17 мес.

Медиана ОВ между группами не различалась: не достигнута и 31 мес.

соответственно; р0,05 (рисунок 12). Также не различалась и медиана БЛВ: 26,7 и 33,5 мес. соответственно; p0,05.

Рисунок 12 – Общая выживаемость и число метилированных генов

Таким образом, результаты исследований, представленных в 5 и 6 главах, дают основание модифицировать отдельные звенья алгоритма лечения больных ОМЛ и МДС. Так, обнаружение моносомного кариотипа должно быть показанием для интенсификации индукционных курсов ХТ и/или раннего выполнения АллоТГСК ввиду низкой эффективности стандартной схемы 7+3, ВДХТ и терапии низкой интенсивности. Одним из вариантов ИР может быть схема “FLAG±Ida”.

Напротив, невозможность проведения стандартной ХТ или ВДХТ больным с рецидивом или резистентным ОМЛ может рассматриваться как показание к назначению такого варианта терапии низкой интенсивности, как схема “малые дозы Ара-Ц с кладрибином”, которая в ряде случаев может значимо редуцировать объем патологического клона и, тем самым, подготовить больного к выполнению АллоТГСК (рисунок 13).

Рисунок 13 – Схема лечения больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС

Отсутствие ответа у больных МДС низкого риска (без избытка бластных клеток в ПК и/или КМ) на эритропоэзстимулирующие, иммуносупрессивные или иммуномодулирующие препараты может быть показанием к инициации терапии гипометилирующими препаратами. Диагностика ОМЛ с МД или обнаружение у больных ОМЛ и МДС комплексного кариотипа может рассматриваться как показание к интенсификации эпигенетической терапии посредством добавления новых препаратов в случае неэффективности монотерапии Дако или 5-Аза, но не их отмены (рисунок 14).

Рисунок 14 – Схема модификации терапии гипометилирующими препаратами

Иллюстрацией терапевтического потенциала комбинации азануклеозидов с Ара-Ц, назначаемого в малых дозах непосредственно после окончания введения гипометилирующих препаратов, являются следующие два клинических наблюдения.

У больного М. 72 лет на фоне нарастающей симптоматики анемического синдрома без видимых и скрытых признаков кровотечения по данным изучения препаратов КМ и ПК был диагностирован МДС, РАИБ-2. При цитогенетическом исследовании обнаружена трисомия 13 и 21. Вариант прогноза по шкале IPSS неблагоприятный (3 балла).

Инициирована терапия 5-аза по стандартной схеме. После 4-х курсов установлена к/мР со снижением содержания бластов в костно-мозговом пунктате до уровня 5 % на фоне персистирующих признаков дисплазии клеток всех ростков миелопоэза.

Продолжена поддерживающая терапия курсами 5-аза без снижения курсовой дозы и удлинения межкурсовых интервалов.

При контрольном обследовании после 9 курса констатирована прогрессия МДС с трансформацией в ОМЛ:

в миелограмме 32 % миелобластов. Новых хромосомных аберраций не выявлено.

Учитывая указание на кардиальную коморбидность, отягощенный соматический статус (3 балла по шкале ECOG) и желание больного, было принято решение воздержаться от интенсивных схем ХТ (7+3, HiDAC). Хорошая переносимость 5-аза при отсутствии клональной прогрессии послужили основанием для продолжения курсов 5-аза с последующим добавлением подкожных инъекций Ара-Ц по 20 мг 2 раза в день на 8–14 дни курса (последовательное введение, sequential therapy). Отсутствие дальнейшего нарастания процентного содержания бластов в КМ в течение 6 мес. при сохраняющейся потребности в трансфузиях компонентов крови позволили расценить эффект от терапии как стабилизация.

Больной К. 48 лет обратился за медицинской помощью в связи с нарастающей слабостью, появлением кровоизлияний на коже. В миелограмме бласты миелоидной природы 51 %. Кариотип нормальный. Мутаций в генах FLT3 и NPM1 не выявлено. Диагностирован ОМЛ, М2 de novo.

После курса 7+3 в стандартных дозировках достигнута ПР. Проведено 2 курса консолидирующей ХТ с введением высокодозного Ара-Ц. Инициирована поддерживающая низкоинтенсивная ХТ, что было обусловлено глубокой и длительной цитопенией, развивающейся после каждого предшествующего курса, с присоединением тяжелых инфекционных осложнений. Сиблингов у больного нет.

Через 16 мес. после достижения ПР развился поздний рецидив без обнаружения дополнительных молекулярно-генетических аберраций. Учитывая низкую клеточность КМ, количество бластных клеток в пунктате КМ на уровне 18 %, а также длительный период постцитостатического восстановления кроветворения на период поиска HLA-совместимого неродственного донора была инициирована комбинированная терапия с внутривенным введением Дако 20 мг/м2 внутривенно в 1–5 дни и подкожным введением Ара-Ц 20 мг однократно в день в 6–10 дни. На фоне восстановления показателей ПК уровень бластных клеток в аспирате КМ снизился до 5,2 %. Терапия продолжена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стратификация больных на группы риска – обязательный элемент алгоритма лечения больных миелоидными неоплазиями, включая ОМЛ и МДС.

Прогнозирование неэффективности стандартных курсов ИР с развитием резистентных вариантов болезни или ранних рецидивов на фоне ВДХТ позволяет своевременно модифицировать интенсивность лечения, запланировать выполнение АллоТГСК в ранние сроки и в итоге значимо увеличить выживаемость больных крайне неблагоприятными вариантами онкогематологических заболеваний.

Для распределения больных ОМЛ и МДС в группы с разным прогнозом предложено множество прогностических шкал, включая классификацию ВОЗ, ELN, IPSS, IPSS-R и другие, основу которых составляют такие хорошо известные по своему прогностическому потенциалу показатели, как количество бластных клеток в костно-мозговом пунктате, характер хромосомных аберраций, мутационный статус отдельных генов. Наряду с оценкой биологического фенотипа лейкозных клеток немаловажное значение приобретают также показатели, характеризующие состояние организма больного: общий соматический статус (шкала Карновского, ECOG) и коморбидность (шкала HCTCI). Невозможность проведения интенсивной терапии по причине пожилого возраста, сопряженного с заболеваниями сердечно-сосудистой системы и низким уровнем сывороточного белка, значимо ухудшают показатели ОВ даже в случае благоприятного варианта кариотипа.

Одним из вариантов лечения больных с отягощенным соматическим статусом в настоящее время рассматривается такой вид терапии низкой интенсивности, как назначение гипометилирующих препаратов: Дако или 5-Аза. В то же время в настоящее время остается не решенной проблема прогнозирования эффективности гипометилирующих препаратов. Не определены варианты ответа, сопряженные с улучшением ОВ. Нет рекомендаций по дальнейшему лечению больных, не ответивших на лечение или у которых развился рецидив на фоне продолжающейся терапии. Результаты ряда публикаций свидетельствуют о низкой выживаемости больных, у которых обнаруживается аберрантное метилирование значительного числа генов. Вместе с тем, значительный объем эпигенетических повреждений у больных миелоидными неоплазиями обосновывает целесообразность не столько отменять гипометилирующие препараты, а наоборот, усиливать воздействие на клетки патологического клона посредством включения в состав существующих схем дополнительных цитостатиков. Однако остается неизвестным, какие варианты ОМЛ характеризуются наиболее неблагоприятным эпигенетическим фоном. И, тем самым, не уточнена категория больных, которым в первую очередь показано подключение химиопрепаратов к гипометилирующим препаратам.

Не менее актуальной остается проблема лечения больных рецидивом или резистентным ОМЛ, которым по разным причинам не может быть проведена ВДХТ. Большинство из этих больных являются потенциальными кандидатами на АллоТГСК, однако низкий соматический статус, как следствие ранее проведенной интенсивной ХТ, и значительный объем опухолевых клеток являются противопоказанием к проведению метода терапии, способной излечить большинство из них. Тем самым актуальной является проблема разработки и апробации программ ХТ низкой интенсивности, проведение которых позволит подготовить больного к проведению миелоаблативных режимов предтрансплантационной подготовки. Данные литературы свидетельствуют о возможности усиления цитостатического воздействия Ара-Ц при добавлении пуриновых аналогов и, в частности, кладрибина. В связи с этим несомненный клинический интерес представляет лечебный потенциал комбинации малых доз Ара-Ц с кладрибином.

Известно, что многие прогностические факторы, включенные в состав прогностических шкал, обладают высоким самостоятельным прогностическим потенциалом. Одним из независимых прогностических факторов является кариотип. Вместе с тем, следует признать, что многообразие вариантов цитогенетических аберраций, которые могут встретиться в клинической практике, не позволяет установить значимость отдельных хромосомных поломок и их сочетаний. В то же время выделены и такие варианты кариотипа, крайне негативное влияния которых на течение ОМЛ и МДС не зависит от характера хромосомных аберраций. Речь идет, в частности, о комплексном кариотипе, представляющем сочетание 3 и более независимых хромосомных аберраций.

Другим крайне неблагоприятным вариантом является недавно выделенный моносомный кариотип. Однако не ясно, следует ли больным ОМЛ и МДС, у которых в дебюте заболевания обнаруживается моносомный кариотип, проводить стандартную ИР или интенсифицировать ХТ.

Решение сформулированных проблем представляется крайне актуальным, поскольку предоставит условия для модификации отдельных этапов лечения больных ОМЛ и МДС неблагоприятными вариантами.

Для выполнения поставленной цели научно-исследовательская работа была разбита на два этапа. На первом этапе представлялось целесообразным определить, насколько эффективными могут быть гипометилирующие препараты и новая, разработанная в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России, схема комбинированного назначения Ара-Ц с кладрибином в лечении больных крайне неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС.

На втором этапе был предусмотрен анализ результатов изучения клиникогематологических характеристик больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом для определения оптимальной тактики лечения и исследование статуса метилирования генов для определения вариантов миелоидных неоплазий.

Планировалось, что новые данные позволят обосновать включение гипометилирующих препаратов в алгоритм лечения (больные МДС низкого риска) или усиление эпигенетической терапии дополнительным назначением цитостатиков (больные ОМЛ).

Известно, что стандартная схема ИР 7+3 эффективна у 60–80 % больных ОМЛ [22, 60, 127]. Несмотря на последующую консолидирующую и поддерживающую терапию, у основной части больных развивается рецидив [83]. Другим фактором, значимо снижающим ОВ, является резистентность к ХТ [5, 11].

В большинстве национальных клинических рекомендаций [11, 64, 94] для лечения больных рецидивом и резистентным ОМЛ предлагаются разные опции, интенсивность которых определяется возрастом больного (моложе или старше 60 лет) и длительностью постремиссионного периода (менее или более 12 мес.).

Вместе с тем, у большинства больных к моменту решения вопроса о необходимости назначения терапии спасения (salvage therapy) отмечается значительная предлеченность. Более того, длительная интенсификация лечения не всегда приводит к ожидаемому ответу, а увеличение разовых и кумулятивных доз химиопрепаратов повышает риск развития серьезных нежелательных событий нелейкозной природы с ухудшением бессобытийной выживаемости.

Практический интерес к назначению кладрибина (2-хлордеоксиаденозин) больным неблагоприятными вариантами ОМЛ обусловлен его способностью взаимодействовать с другими цитостатиками с модуляцией, например, биоактивности Ара-Ц [76, 78]. C. Freyer с соавт. [116] в обзоре литературы приводят данные 15 исследований по оценке клинической эффективности кладрибина: частота ПР варьирует от 0 до 59 %, медиана ОВ находится в диапазоне от 1,9 до 10,7 мес. При этом наилучшие показатели отмечены при одновременном использовании кладрибина и высокодозного Ара-Ц (схема CLAG±Mitoxantrone).

Наряду с высокодозным Ара-Ц рекомендованы курсы подкожного введения препарата в малых дозах в режиме моно- или комбинированной ХТ. Так, L. Liu с соавт. [77] для лечения 37 больных использовали схему CAG, включающую Ара-Ц по 10 мг/м2 подкожно каждые 12 часов, акларубицин по 5–7 мг/м2 внутривенно однократно в день и Г-КСФ по 200 мкг/м2 подкожно. Все препараты вводились с 1 по 14 дни курса. Общий ответ (ПР+ЧР) после первого курса был констатирован у 29 больных (78,4 %), включая ПР у 23 больных (62,2 %).

Медиана ОВ составила 6 мес. Токсичность курса была умеренной.

Результаты собственного исследования свидетельствуют о высоком лечебном потенциале комбинации малых доз Ара-Ц с кладрибином. Основанием для такого заключения является ответ у 5 из 10 больных, включая ПР у двух больных.

Короткая длительность ответа (2-3 мес.) объясняется сроками наблюдения за больными. За этот период трем больным была выполнена АллоТГСК и одному в связи со значительной редукцией объема патологического клона инициирован поиск донора.

Токсичность комбинации комбинированной терапии умеренная. Случаев ранней смерти не было. Снижение показателей ПК, послужившее причиной развития тяжелых инфекционных осложнений у отдельных больных и назначения инфузий донорских эритроцитов и тромбоконцентрата практически всем больным, могло быть следствием миелотоксического действия ХП. В то же время не исключено вытеснение нормальных ростков миелопоэза лейкозными клетками.

Однако независимо от механизмов развития цитопении следует признать, что одним из условий проведения курса малых доз Ара-Ц с кладрибином должен быть тщательный клинико-гематологический мониторинг.

Небольшое число наблюдений не дает оснований для выделения факторов, ассоциированных с ответом. Вместе с тем, обращают внимание следующие данные. Эффективность курса констатирована у больных ОМЛ de novo без мутаций FLT3-ITD и гена c-KIT. Длительность курса была от 10 до 21 дня у больных с ПР и 7–14 дней у больных с ЧР. Последний факт позволяет предположить, что лечебный эффект опосредован дифференцирующим действием малых доз Ара-Ц и цитостатическим действием кладрибина.

Эпигенетические нарушения, в частности, метилирование ДНК, – непосредственные участники лейкозогенеза. Обратимость аберрантного метилирования позволяет использовать данный феномен в терапевтических целях в виде назначения азануклеозидов: Дако и 5-Аза.

Лечебный эффект азануклеозидов опосредован инактивацией ДНКметилтрансфераз с последующим переводом цитозиновых остатков ДНК в неметилированное состояние, что, в конечном счете, сопровождается реэкспрессией генов-супрессоров опухоли, нормализацией ряда физиологических процессов и апоптозом лейкозных клеток.

Особенности механизма действия азануклеозидов, а именно модификация биологического фенотипа лейкозных клеток, обусловливают отсроченный ответ на лечение, приемлемый профиль токсичности и низкую частоту гипоплазии КМ.

Это делает азануклеозиды привлекательной опцией для лечения больных МДС и ОМЛ пожилого возраста, большинство из которых не являются кандидатами на интенсивную ХТ, в то время как стандартная ХТ малыми дозами Ара-Ц характеризуется крайне низкой эффективностью [3, 9, 16].

Регистрация гипометилирующих препаратов для лечения больных МДС, включая варианты с 20–30 % бластов в костном мозге, которые согласно классификации ВОЗ относятся к ОМЛ, позволила существенно изменить клиническую ситуацию. Так, в многоцентровом проспективном рандомизированном исследовании III фазы AZA-001 было продемонстрировано значимое увеличение медианы ОВ больных МДС промежуточного-2 и высокого IPSS риска, получавших 5-Аза: 24,5 мес. против 15,0 мес. в группе больных, которым проводилась интенсивная ХТ, малые дозы Ара-Ц или терапия поддержки; р=0,0001 [56].

А. Quintas-Cardama с соавт. [59] при ретроспективном анализе данных 671 больного ОМЛ в возрасте 65 лет, которые получали ВДХТ или гипометилирующие препараты, не обнаружили различия между группами по показателям 2-летней БЛВ и медиане ОВ: 28 против 39 %; р=0,843 и 6,7 против 6,5 мес.; р=0,413 соответственно. Учитывая меньшее число ПР среди больных, которым назначались азануклеозиды, сделано предположение, что эффективный контроль за лейкозным клоном, независимо от исходного уровня бластов в КМ, возможен и при других вариантах ответа, нежели ПР, а снижение смертности от осложнений агрессивного лечения в этом случае трансформируется в длительную ОВ, сопоставимую с показателями при проведении ВДХТ.

Данный клинико-гематологический феномен, а именно контролирование объема лейкозных клеток при минимальной гематологической и негематологической токсичности, дает основание рассматривать многими авторами азануклеозиды как bridge-therapy для молодых больных МДС на период подготовки к АллоТГСК [138].

Частота общего ответа в группе из 27 больных, получавших Дако, в целом соответствует данным литературы [15, 92, 47, 21, 126]. Вместе с тем, преобладание такого варианта ответа, как стабилизация со снижением потребности в переливаниях донорских эритроцитов, не позволяет признать результаты удовлетворительными. Вполне ожидаемым был ответ у основной части больных ХМПН [15, 137], в то же время ни один больной ОМЛ не ответил на лечение.

Факт необнаружения значения возраста и предшествующего лечения на результаты терапии Дако, возможно, обусловлен небольшим числом больных.

Тем не менее, следует признать, что одним из факторов, негативно влияющих на эффективность терапии, является отсроченное назначение Дако [47, 126, 137].

Так, D. Steensma с соавт. [126] было отмечено снижение частоты ПР у больных МДС с 19 % до 11 % в случае указания в анамнезе на предшествующее лечение и длительность заболевания более 1 года. H. Kantarjian c соавт. [137] было установлено негативное влияние длительного периода до назначения Дако на вероятность ответа, в то время как проведение лечения в ранние сроки положительно отражалось на достижении ответа и ОВ. В отличие от A. Cashen с соавт. [92], которые констатировали ПР у 24 % больных ОМЛ старше 60 лет при назначении Дако в первой линии, в собственном исследовании только 2 из 6 больных ОМЛ ранее не получали специфического лечения. Вероятно, этот же факт, а именно применение Дако в качестве 2 линии терапии в период прогрессии заболевания или формирования резистентности к ХП, послужил одной из причин низкой эффективности Дако у больных МДС. Так, если в проведенном исследовании у больных МДС частота ПР была 21,4 % и медиана ОВ 5,9 мес., то в исследовании ADOPT эти же показатели составили 32 % и 19,4 мес. [126], а в исследовании DIVA – 36 % и 17,7 мес. соответственно [21].

Прогрессия заболевания в течение первого года у 38,5 % больных, ответивших на лечение (включая больных с ПР) и продолжающих получать лечение, свидетельствует о комплексном характере патобиологических процессов, принимающих участие в лейкозогенезе, и недостаточности только лишь реактивации генов-супрессоров опухоли [34, 52, 98, 118] для достижения длительного и стабильного клинико-гематологического ответа. Одним из возможных вариантов усиления лечебного действия рассматривается комбинация Дако с ХП.

Так же, как и при назначении Дако, эффективность 5-Аза выше в случае его назначения в первой линии терапии [25]. Немаловажным предиктором улучшения ОВ рассматривается достижение ответа на лечение.

Последний тезис подтвержден результатами собственного исследования.

Обнаружено, что в группе, объединяющей больных с ПР, к/мР и гематологическим улучшением, ОВ составила 15,9 мес. Это было значимо выше, чем у больных, у которых была достигнута стабилизация болезни с сохраняющейся потребностью в трансфузиях или прогрессия – 7,4 мес.;

р=0,010. О клинически благоприятном значении снижения интенсивности трансфузионной терапии или полного отказа от переливаний в совокупности со стабильным улучшением показателей ПК свидетельствует факт выявления худших показателей ОВ у больных со стабилизацией болезни: 8 мес. против 10,2 мес. у больных с ГУ.

Феномен улучшения выживаемости больных ОМЛ и МДС при достижении ГУ, вероятно, обусловлен частичным подавлением патологического клона, создающего условия для увеличения объема нормального кроветворения [120].

Дополнительным фактором может быть и благотворное воздействие 5-Аза на стромальное микроокружение [26]. Нельзя исключать и биологические особенности лейкозных клеток ОМЛ с уровнем бластных клеток от 20 до 29 % [49].

Независимо от механизмов, опосредующих клиническое улучшение, следует обратить внимание на тот факт, что принципиальное условие для достижения данного эффекта – продолжающаяся терапия 5-Аза. В противном случае следует ожидать быстрой потери ответа с прогрессией болезни [112].

В проведенном исследовании ГУ было зафиксировано после 2–6 курсов. Это дает основание рекомендовать проведение не менее 6 курсов до окончательной оценки результатов терапии и принятия решения о дальнейшей тактике лечения.

Кариотип – один из значимых прогностических факторов у больных ОМЛ и МДС [11, 50, 115]. Многообразие цитогенетических поломок у больных ОМЛ и МДС объясняет непрекращающийся интерес к изучению прогностической ценности отдельных хромосомных аберраций и их многочисленных комбинаций и в частности, к выделенному в 2008 году, так называемому, моносомному кариотипу [89]. Предполагается, что моносомный кариотип ассоциирован со значимым ухудшением ОВ из-за нестабильности генома лейкозных клеток, активации механизмов множественной лекарственной резистентности, повреждения гена ТР53 [20, 88, 91, 134].

Независимо от причин, обусловливающих неблагоприятное влияние моносомного кариотипа на эффективность лечения, отдельными авторами предполагается, что выявление моносомного кариотипа должно быть основанием для кардинального изменения тактики лечения. Это ранние сроки выполнения АллоТГСК и иные, нежели стандартные, схемы ИР [66].

Результаты выполненного исследования свидетельствуют, прежде всего, о вариабельности ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом. Различие больных по возрасту, характеру заболевания (de novo и вторичный), морфологическим находкам и цитогенетическим характеристикам (количество аберраций, вид и число моносомий) в совокупности с отсутствием неслучайной аберрантной экспрессии антигенов дифференцировки на поверхности бластных клеток не дают оснований для объединения случаев с моносомным кариотипом в самостоятельную группу.

Тем самым, спрогнозировать вероятность обнаружения у больных ОМЛ или МДС моносомного кариотипа до получения результатов цитогенетического исследования невозможно.

Данный вывод приобретает весомое значение, если принять во внимание тот факт, что основная часть больных ОМЛ и МДС не ответила на стандартные курсы ХТ.

Эти данные, а именно отсутствие ассоциации моносомного кариотипа с отдельными клиническими и лабораторными показателями и низкая частота ПР, позволяют сделать следующий вывод: лечение больных ОМЛ и МДС высокого риска следует инициировать после получения результатов цитогенетического исследования. Иначе говоря, выбор протокола лечения больных ОМЛ и МДС с избыточным количеством бластов должен осуществляться по результатам изучения кариотипа. Учитывая возможное негативное влияние на исход терапии удлинения интервала от момента верификации диагноза до начала введения ХП [132, 133], рекомендовано придерживаться сформулированного положения только при условии доступности результатов цитогенетического исследования в течение 72 часов. Возможными схемами рассматривается курс ВДХТ “FLAG±” или 5-Аза у больных с умеренным уровнем бластных клеток в КМ [28, 66, 139].

В отличие от генетических повреждений, при эпигенетических нарушениях изменение структуры хроматина и инактивация генов осуществляется без нарушения последовательности нуклеотидов в ДНК. Тем не менее, эпигенетические нарушения наряду с молекулярно-генетическими аберрациями и повреждением гемопоэтического микроокружения принимают непосредственное участие в механизмах возникновения и развития лейкозного клона.

Наибольшее внимание, уделяемое метилированию цитозина в островках CpG, локализованных вблизи или непосредственно в промоторных областях генов, неслучайно. Метилирование – доминирующий эпигенетический феномен в лейкозных клетках [80].

При изучении метилирования аберрантный статус островков CpG обнаружен во многих генах, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла механизмов дифференцировки, адгезии, апоптоза и роста клеток. Частота и степень метилирования в разных генах разная. Установлена сопряженность аберрантного статуса отдельных генов с возрастом и фенотипом бластных клеток [6].

Наибольший научный и практический интерес представляет вопрос о взаимосвязи аберрантного статуса метилирования с эффективностью терапии больных ОМЛ и МДС. Как было установлено, увеличение числа метилированных генов до 2-3 и более ассоциировано с крайне неблагоприятным течением в виде отсутствия ответа или значимого снижения ОВ даже в случае достижении ПР на фоне терапии 5-А [93, 103].

Результаты пилотного исследования статуса метилирования двух генов (р15INK4B и SOX7) позволили обнаружить сопряженность аберрантного метилирования с количеством бластных клеток в КМ и вариантом кариотипа у больных МДС, а в группе ОМЛ – с морфологическим фенотипом лейкозных клеток. Кроме того, была установлено негативное влияние аберрантного метилирования генов на характер течения миелоидных неоплазий.

Полученные данные явились основанием для расширения числа изучаемых генов с целью выделения групп больных, в которых показано расширение показаний для назначения азануклеозидов (МДС низкого риска) или интенсификация терапии в виде подключения ХП к азануклеозидам (ОМЛ и МДС высокого риска).

Для дальнейшего исследования панель изучаемых генов была расширена путем добавления генов – антагонисты сигнального пути Wnt: SFRP1, SFRP4 и SFRP5. Это было обусловлено непосредственным участием сигнального пути Wnt в регуляции процессов выживаемости, пролиферации и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток. Тем самым, повреждения сигнального пути Wnt, включая метилирование отдельных генов, рассматривается как один из механизмов лейкозогенеза [130].

Результаты проведенного исследования свидетельствуют, прежде всего, о том, что метилирование генов-супрессоров лейкозной трансформации является ранним биологическим механизмом патогенеза МДС. Основанием для такого заключения является достаточно высокая частота аберрантного метилирования изученных генов у больных с низким уровнем бластных клеток в КМ. Полученные данные обосновывают целесообразность включения азануклеозидов в алгоритм лечения больных МДС низкого риска.

Обнаружение гена SFRP5 в метилированном состоянии преимущественно у больных с избытком бластов и, прежде всего, в группе РАИБ-2 позволяет рассматривать аберрантное метилирование гена SFRP5 как позднее эпигенетическое событие, возникновение которого сопряжено со значительным объемом бластных клеток.

Кроме того, обнаружение случаев с метилированием единичных генов преимущественно у больных без избытка бластов и отчетливая тенденция к увеличению числа генов с аберрантным метилированием до 3–5 у больных РАИБ-2 дает основание для заключения об ассоциативной связи между прогрессией МДС и увеличением числа метилированных генов-антагонистов сигнального пути Wnt.

При изучении статуса метилирования у больных ОМЛ было установлено, что аберрантное метилирование 3–5 генов является преимущественной находкой среди больных с миелодисплазией или с комплексным кариотипом. Полученные данные позволяет прогнозировать низкую эффективность монотерапии гипометилирующими препаратами у этой категории больных. Так, M. Abaigar с соавт. [103] установили значимое снижение ОВ больных ОМЛ и МДС, у которых число метилированных генов было 2 (р=0,022).

Совокупный анализ собственных находок с данными литературы, в частности, о реэкспрессии гена p15INK4b и антагонистов сигнального пути Wnt in vitro при добавлении 5-Аза к культуре лейкозных клеток [103], делает обоснованным назначение больным ОМЛ с МД или с комплексным кариотипом азануклеозидов в комбинации с цитостатиками [63, 114] и, в частности с малыми дозамиАра-Ц [24].

Для последующей оценки прогностической значимости аберрантного статуса метилирования были отобраны больные ОМЛ с нормальным кариотипом и не имеющие мутаций в генах FLT3 и NPM1. Это обусловлено выраженной клинической вариабельностью течения заболевания у лиц указанной группы, когда выбор интенсивности постремиссионной терапии затруднителен и, следовательно, актуальным представляется поиск новых прогностических факторов. Сопряженности показателей ОВ и/или БРВ с числом метилированных генов выявлено не было.

Таким образом, исследования, проведенные в ходе выполнения диссертационной работы, еще раз подчеркивают выраженную клиническую и биологическую гетерогенность ОМЛ и МДС. Полученные данные позволяют улучшить качество лечения больных наиболее неблагоприятным вариантам ОМЛ и МДС путем внедрения в клиническую практику новой схемы ХТ и оптимизации терапии гипометилирующими препаратами. Кроме того, результаты исследования открывают возможности для дальнейшего усовершенствования лечебного пособия, оказываемого больным миелоидными неоплазиями, посредством интенсификации ХТ в случае обнаружения комплексного кариотипа или неэффективности монотерапии азануклеозидами.

ВЫВОДЫ

1. Терапия низкой интенсивности может сопровождаться достижением ответа и улучшением выживаемости части больных неблагоприятными вариантами ОМЛ и МДС, которым по разным причинам не может быть назначена стандартная или высокодозная химиотерапия. Условие повышения эффективности лечения – отбор больных по результатам комплексного клинико-лабораторного обследования.

2. Разработана и апробирована новая комбинированная схема лечения низкой интенсивности (малые дозы цитарабина плюс кладрибин), которая в виду вероятности достижения ответа у 50 % больных и приемлемого профиля токсичности может быть использована как один из способов подготовки больных с рецидивом или резистентным ОМЛ к трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при невозможности проведения интенсивной терапии.

3. Эффективность гипометилирующих препаратов (децитабин, 5-азацитидин) зависит от характера хромосомных аберраций и варианта ответа. Наихудшие показатели выживаемости больных ОМЛ и МДС констатированы при комплексном кариотипе и отсутствии одного из вариантов ответа.

4. Одним из условий улучшения общей выживаемости больных ОМЛ и МДС, получающих терапию гипометилирующими препаратами, является достижение гематологического улучшения в виде уменьшения зависимости или полного отказа от трансфузий компонентов крови.

5. Обнаружение моносомного кариотипа ассоциировано с крайне низкой выживаемостью больных ОМЛ и МДС. Медиана общей выживаемости больных ОМЛ и МДС с моносомным кариотипом составляет 6 и 8 мес. соответственно.

6. Прогрессирование МДС в виде нарастания бластных клеток в костном мозге сопряжено с увеличением числа генов с аберрантным метилированием. При этом метилирование гена SFRP5 является поздним эпигенетическим событием.

7. Группа больных ОМЛ с комплексным кариотипом характеризуется большим числом наблюдений с аберрантным метилированием одновременно 5 генов по сравнению с больными, у которых выявлены другие варианты кариотипа: 50,0 против 8,3 %; p=0,01. У 70 % больных ОМЛ с миелодисплазией обнаружено аберрантное метилирование одновременно 3–5 генов, что выше по сравнению с больными другими морфологическими вариантами ОМЛ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Больным с рецидивом или резистентным ОМЛ, которым по разным причинам не может быть назначена стандартная или высокодозная химиотерапия, целесообразно проведение 1-2 курсов комбинированной терапии «малые дозы цитарабина плюс кладрибин». Вероятность ответа на данный вид терапии низкой интенсивности выше при длительности курса не менее 10 дней, а также в случае отсутствия мутаций FLT3-ITD и в гене c-KIT.

2. При возможности выполнения цитогенетического исследования в течение первых 72 часов диагностики ОМЛ и МДС с избыточным содержанием бластных клеток выбор индукционной терапии следует отложить до получения результатов изучения кариотипа. В случае обнаружения моносомного кариотипа интенсивность индукционного курса должна быть усилена ввиду низкой эффективности стандартной схемы 7+3.

3. При достижении гематологического улучшения на фоне терапии гипометилирующими препаратами лечение следует продолжить, так как снижение частоты инфузий или полный отказ от трансфузий донорских эритроцитов сопровождается улучшением выживаемости больных ОМЛ и МДС.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-Аза – 5-азацитидин Ара-Ц – цитарабин АллоТГСК – аллогенная ТГСК АутоТГСК – аутологичная ТГСК БЛВ – безлейкозная выживаемость БРВ – безрецидивная выживаемость БСВ – бессобытийная выживаемость ВДХТ – высокодозная химиотерапия ГУ-Эр – гематологическое улучшение, эритроцитарный ответ Дако – децитабин ДНМТ – ДНК-метилтрансфераза ИР – индукция ремиссии ИФН-а – интерферон альфа КМ – костный мозг к/мР – костно-мозговая ремиссия МДС – миелодиспластический синдром Ме – медиана НЗ – незначимо НД – нет данных ОВ – общая выживаемость ОЛЛ – острый лимфобластный лейкоз ОМЛ – острый миелоидный лейкоз ОМЛ с МД – острый миелоидный лейкоз с миелодисплазией ПК – периферическая кровь ПМФ – первичный миелофиброз ПР – полная ремиссия РА – рефрактерная анемия РАКС – рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов РАИБ-Т – рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией ТГСК – трансплантация гемопоэтических стволовых клеток ХМЛ – хронический миелолейкоз ХММоЛ – хронический миеломоноцитарный лейкоз ХМПН – хроническая миелопролиферативная неоплазия ХП – химиопрепараты ХТ – химиотерапия ЦР – цитогенетическая ремиссия ЧР – частичная ремиссия IPSS – International Prognostic Scoring system (Международная шкала прогноза) IPSS-R – International Prognostic Scoring system, revised (Международная шкала прогноза, обновленная) IWG – International working group (Международная рабочая группа) FAB – French-American- British (Франко-Американо-Британская) классификация HDAC – гистондеацетилаза

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при остром миелобластном лейкозе в первой ремиссии / С.Н.Бондаренко, Е.В. Семенова, В.Н. Вавилов и др. // Терапевтический архив. - 2013. - Том 85,№ 7. - С.18-25.

2. Возраст и кариотип - факторы риcка у больных первичным острым миелоидным лейкозом / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, Л.С. Мартыненко и др. // Клиническая онкогематология. - 2010. - №4. - С. 359-364.

3. Возрастные особенности кариотипа больных острым миелоидным лейкозом / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, Л.С. Мартыненко и др. // Терапевтический архив. - 2011. - Том 83, №1. - С. 51-55.

4. Гематология. Национальное руководство по гематологии / Под ред.

О.А. Рукавицина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 300-333 с.

5. Гетерогенность острого миелоидного лейкоза с транслокацией t(8;21)(q22;q22) / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, И.С. Зюзгин и др. // Терапевтический архив. Том 86, № 7. - С.45-52.

6. Грицаев, С.В Метилирование промотерных областей генов как один из механизмов лейкозогенеза и “мишень” для лекарственного воздействия при лечении больных миелоидными неоплазиями / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, В.Ю. Аксенова // Вестник гематологии. - 2011. - № 2. С.78-85.

7. Клинико-гематологические и иммунофенотипические особенности больных de novo острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) с мутацией FLT3-ITD / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, Ж.В. Чубукина и др. // Вестник гематологии.

- 2012. - №4. - С. 10-14.

8. Клинико-эпидемиологическая характеристика острых миелоидных лейкозов у взрослых по данным муниципальных отделений гематологии Москвы / С.В. Семочкин, Т.Н. Толстых, Н.В. Архипова и др. // Терапевтический архив. Том 87, № 7. - С.26-32.

9. Комплексный кариотип – маркер крайне неблагоприятного прогноза у больных острыми миелоидными лейкозами и развернутыми вариантами миелодиспластического синдрома старше 70 лет с высоким индексом коморбидности / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, К.М. Абдулкадыров и др. // Терапевтический архив. -2012. -Том 84,№ 7. -С.16-21.

10. Лечение больных острыми миелоидными лейкозами по протоколу российского многоцентрового рандомизированного исследования ОМЛ-01.10:

результаты координационного центра / Е.Н. Паровичникова, В.В. Троицкая, Г.А. Клясова и др. // Терапевтический архив. - 2014. - Том 86,№ 7. - С.14-23.

11. Национальные клинические рекомендации по диагностике лечению острых миелоидных лейкозов взрослых / В.Г. Савченко, Е.Н. Паровичникова, Б.В.

Афанасьев и др. // Гематология и трансфузиология. -2014. - №1: Приложение 2. - С.23-53.

12. Aberrant CpG island methylation in acute myeloid leukemia is accentuated at relapse / H. Kroeger, J. Jelinek, M.R.H. Estecio et al. // Blood. -2008.- Vol. 112, №4. - P.1366-1373.

13. Aberrant DNA methylation is a dominant mechanism in MDS progression to AML / Y. Jiang, A. Dunbar, L.P. Gonder et al. // Blood. - 2009. - Vol.113. - P.1315-1325.

14. Abberrant p15 promoter methylation in adult and childhood acute leukemias of nearly all morphologic subtypes: potential prognostic implications / I.H.N. Wong, M.H.L. Ng, D.P. Huang, J.C. Lee // Blood. - 2000. - Vol.95. - P.1942-1949.

15. Activity of decitabine, a hypomethylating agent, in chronic myelomonocytic leukemia / A. Aribi, G. Borthakur, F. Ravandi et al. // Cancer. -2007. - Vol.109, № 4. - P.713-717.

16. A comparison of low-dose cytarabine and hydroxyurea with or without all-trans retinoic acid for acute myeloid leukemia and high-risk myelodysplastic syndrome in patients not considered fit for intensive treatment / A.K. Burnett, D. Milligan, A.G. Prentice et al. // Cancer. -2007. - Vol.109, № 6. - P.1114-1124.

17. A limited number of 5-azacitidine cycles can be effective treatment in MDS / C. Mller-Thomas, T. Schuster, C. Peschel, K.S. Gtze // Ann. Hematol. - 2009. Vol.88. - P.213-219.

18. A multicenter, open, non-comparative, phase II study of the combination of cladribine, cytarabine, and G-CSF and induction therapy in refractory acute myeloid leukemia - a report of the Polish Adult Leukemia Group (PALG) / A. Wrzesien-Kus, T. Robak, E. Lech-Maranda et al. // Eur. J. Hematol. - 2003. - Vol. 71, №3. P.155-162.

19. A new Leukemia Prognostic Scoring System for refractory/relapsed adult acute myelogeneous leukaemia patients: a GOELAMS study / P. Chevallier, M. Labopin, P. Turlure et al. // Leukemia. -2011. - Vol.25, №6. -P. 939-944.

20. A phase I trial of ribavirin and low-dose cytarabine for the treatment of relapsed and refractory acute myeloid leukemia with elevated eIF4E / S. Assouline, B. Culjkovic-Kraljacic, J. Bergeron et al. // Haematologica. -2015. - Vol.100, №1. e 7-9.

21. A prospective multicenter observational study of decitabine treatment in Korean patients with myelodysplastic syndrome / J.H. Lee, J.H. Jang, J. Park et al. // Haematologica. - 2011. - Vol. 96, №10. - P.1441-1447.

22. A randomized investigation of high dose versus standard-dose cytosine arabinoside with daunorubicin in patients with previously untreated acute myeloid leukemia: a Southwest Oncol. Group study / J.K. Weick, K.J. Kopecky, F.R. Appelbaum et al. // Blood. - 1996. - Vol. 88, №8. - P.2841-2851.

23. A stratification system for evaluating and selecting therapies in patients with relapsed or primary refractory acute myelogenous leukemia / E. Estey, S. Kornblau, S. Pierce et al. // Blood. - 1996. - Vol.88, №2. - P.756.

24. Azacitidine and low-dose cytarabine in palliative patients with acute myeloid leukemia and hidh bone marrow blast counts – a retrospective single-center experience / A. Radujkovic, S. Dietrich, T. Bochtler et al. // Eur. J. Haematol. – 2014. - Vol. 93. № 2. - P.112-117.

25. Azacitidine in 302 patients with WHO-defined acute myeloid leukemia: results from the Austrian Azacitidine Registry of the AGMT-study Group / L. Pleyer, S. Burgstaller, M. Girschikofsky et al. // Ann. Hematol. - 2014. - Vol.93, №.11. P.1825-1838.

26. Azacitidine treatment in high risk myelodysplastic patients in complete haematological remission reverts mesenchymal stem cells to a normal phenotype / A. Poloni, G. Maurizi, D. Mattiucci et al. // Blood. - 2014. - Vol.124, №21. - Abstr.

1904.

27. Baylin, S.B. DNA methylation and gene silencing in cancer / S.B. Baylin // Nat.

Clin. Pract. Oncol. – 2005. - Vol. 2 (Suppl. 1). - P. 4–11.

28. Bhella S.D., Atenafu E.G., Schuh A.C. et al. FLAG-IDA has significant activity as frontline induction or salvage therapy for patients with high risk and/or relapsed or refractory acute myeloid leukemia // Blood. - 2014. - Vol.124, №21. - Abstr. 5285.

29. Bone marrow transplants may cure patients with acute leukemia never achieving remission with chemotherapy / J.C. Biggs, M.M. Horowitz, R.P. Gale et al. // Blood.

- 1992. - Vol.80, №4. - P.1090-1093.

30. Boultwood, J. Gene silencing by DNA methylation in haematological malignancies / J. Boultwood, J.S. Wainscoat // Brit. Jour. Haematol. - 2007. -Vol.138. - P. 3-11

31. CDKN2B methylation status and isolated chromosome 7 abnormalities predict responses to treatment with 5-azacytidine / K. Raj, A. John, A. Ho et al. // Leukemia.

- 2007. - Vol.21. - P.1937-1944.

32. Chen, H. Hypermethylation of the p15INK4B gene in acute leukemia and myelodysplastic syndromes / H. Chen, S. Wu // Clin. Med. J. - 2002. - Vol.115. P.987-990.

33. Christiansen, D.H. Methylation of p15INK4B is common, associated with deletion of genes on chromosome arm 7q and predicts a poor prognosis in therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia / D.H. Christiansen, M.K. Andersen, J.

Pedersen-Bjergaard // Leukemia. - 2003. - Vol.17. - P. 1813-1819.

34. Chromatin remodeling is required for gene reactivation after decitabine-mediated DNA hypomethylation / J. Si, Y.A. Boumber, J. Shu et al. // Cancer Res. - 2010. Vol.70. - P.6968-6977.

35. Claus, R. Epigenetic targets in hematopoietic malignancies / R. Claus, M. Lubbert // Oncogene. - 2003. - Vol.22. - P.6489-6496.

36. Clinical application and proposal for modification of the International Working Group (IWG) response criteria in myelodysplasia / B.D. Cheson, P.L. Greenberg, J.M. Bennett et al. // Blood. - 2006. - Vol.108, N2. - P.419-425.

37. Clinical implications of aberrant DNA methylation patterns in acute myelogenos leukemia / O. Galm, S. Wilop, C. Luders et al. // Ann. Hematol. - 2005. - Vol. 84. P. 39-46.

38. Clinical study of Mito-FLAG regimen in treatment of relapsed acute myeloid leukemia / S. Luo, F. Cai, L. Jiang et al. // Exp. Ther. Med. - 2013. - Vol.5, №3. P.982-986.

39. Clofarabine plus cytarabine compared with cytarabine alone in older patients with relapsed or refractory acute myelogenous leukemia: results from the CLASSIC I Trial / S. Faderl, M. Wetzler, D. Rizzieri et al. // J. Clin. Oncol. -2012. - Vol.30, №20. P.2492-2499.

40. Clofarabine with high dose cytarabine and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) priming for relapsed and refractory acute myeloid leukaemia / P.S. Becker, H.M. Kantarjian, F.R. Appelbaum et al. // Br. J. Haematol. - 2011. - Vol.155, №2. P. 182-189.

41. Combined DNA methyltransferase and histone deacetylase inhibition in the treatment of myeloid neoplasms / S.D. Gore, S. Baylin, E. Sugar et al. // Cancer Res.

-2006. -Vol. 66. - P.6361-6369.

42. Combination chemotherapy with low-dose cytarabine, homoharringtonine, and granulocyte colony-stimulating factor priming in patients with relapsed or refractory acute myeloid leukemia / W.G. Zhang, F.X. Wang, Y.X. Chen et al. // Am. J.

Hematol. - 2008. - Vol.83, №3. - P.185-188.

43. Comorbidity-age index: a clinical measure of biologic age before allogeneic hematopoietic cell transplantation / M.L. Sorror, R.F. Storb, B.M. Sandmaier et al. // J. Clin. Oncol. - 2014. - Vol.32, №29. - P.3249-3256.

44. Complex or monosomal karyotype and not blast percentage is associated with poor survival in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome patients with inv(3)(q21q26.2)/t(3;3)(q21;q26.2): a Bone Marrow Pathology Group study / H.J. Rogers, J.W. Vardiman, J. Anastasi et al. // Haematologica. - 2014. Vol.99, № 5. - P.821-829.

45. Continued azacitidine therapy beyond time of first response improves quality of response in patients with higher-risk myelodysplastic syndromes / L.R. Silverman, P. Fenaux, G.J. Mufti et al. // Cancer. - 2011. - Vol.117. - P.2697-2702.

46. Cytarabine and clofarabine after high-dose cytarabine in relapsed or refractory AML patients / B. Scappini, G. Gianfaldoni, F. Caracciolo et al. // Am. J. Hematol. Vol.87, №12. - P.1047-1051.

47. Decitabine in myelodysplastic syndromes and chronic myelomonocytic leukemia:

Argentinian/South Korean multi-institutional clinical experience / M. Iastrebner, J.A.

Jang, E. Nucifora et al. // Leukemia Lymph. - 2010. - Vol. 51. - P.2250-2257.

48. Decitabine versus 5-azacitidine for the treatment of myelodysplastic syndrome:

adjusted indirect meta-analysis / A. Kumar, A.F. List, I. Hozo et al. // Haematologica.

- 2010. - Vol.95. - P.340-342.

49. De novo acute myeloid leukemia with 20–29% blasts is less aggressive than acute myeloid leukemia with 30% blasts in older adults: a Bone Marrow Pathology Group study / R.P. Hasserjian, F. Campigotto, V. Klepeis et al. // Am. J. Hematol. - 2014. Vol. 89, №11. - P.193-199.

50. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet / H. Dohner, E.H. Estey, S. Amadori et al. // Blood. - 2010. - Vol.115, №3. P.453-474.

51. DNA methylation changes after 5-Aza-2’-deoxycytidine therapy in patients with leukemia / A.S. Yang, K.D. Doshi, S.W. Choi et al. // Cancer Res. - 2006. - Vol.66.

- P.5495-5503.

52. DNA methylation predicts survival and response to therapy in patients with myelodysplastic syndromes / L. Shen, H. Kantarjian, Y. Guo et al. // J. Clin. Oncol. Vol.28. - P.605-613.

53. DNA methylation profiles and their relationship with cytogenetic status in adult acute myeloid leukemia / S. Alvarez, J. Suela, A. Valencia et al. // PLoS ONE. Vol. 5. - e12197.

54. DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia / M.E. Figueroa, S. Lugthart, Y. Li et al. // Cancer Cell. -2010. - Vol. 17. P.13-27.

55. Eastern Cooperative Oncology Group Leukemia Committee. Failure of three novel regimens to improve outcome for patients with relapsed or refractory acute myeloid leukaemia: a report from the Eastern Cooperative Oncology Group / M.R. Litzow, M. Othus, L.D. Cripe et al // Br. J. Haematol. - 2010. - Vol.148, №2 - P.217-225.

56. Efficacy of azacitidine compared with that of conventional care regimens in the treatment of higher-risk myelodysplastic syndromes: a randomized, open-label, phase III study / P. Fenaux, G. Mufti, E. Hellstrom-Lindberg et al. // Lancet Oncol. - 2009.

- Vol.10. - P.223-232.

57. Efficacy of hypomethylating agents in the treatment of myelodysplastic syndromes:

a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials / A. Kumar, A.F. List, R. Mhaskar, B. Djulbegovic // Blood. -2008. - Vol.112. - abstr. 3632.

58. Epidemiology of myelodysplastic syndromes and chronic myeloproliferative disorders in the United States, 2001-2004, using data from the NAACCR and SEER programs / D.E. Rollison, N. Howlader, M.T. Smith et al. // Blood. - 2008. Vol.112. - P.45-52.

59. Epigenetic therapy is associated with similar survival compared with intensive chemotherapy in older patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia / A. Quintas-Cardama, F. Ravandi, T. Liu-Dumlao et al. // Blood. - 2012. Vol.120, №24. - P.4840-4845.

60. Estey, E.H. Acute myeloid leukemia: 2014 update on risk-stratification and management / E.H. Estey //Am J. Hematol. - 2014. - Vol.89, №11. - P. 1063-1081.

61. Estey, E.H. Treatment of relapsed and refractory acute myelogenous leukemia / E.H.

Estey // Leukemia. - 2000. - Vol.14, №3. - P.476-479.

62. Estrogen receptor methylation is associated with improved survival in adult acute myeloid leukemia / Q. Li, K.J. Kopecky, A. Mohan et al. // Clinic Cancer Res. Vol.5. - P.1077-1084.

63. Feasibility of azacitidine added to standard chemotherapy in older patients with acute myeloid leukemia - a randomised SAL pilot study / U. Krug, A. Koschmieder, D. Schwammbach et al. // PLOS ONE. - 2012. - Vol.7, №12. - E. 52695.

64. Fey, M.F. Acute myeloblastic leukemias in adult patients: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up / M.F. Fey, C. Buske // Ann.

Oncol. - 2013. - Vol.24 (Suppl. 6). - P. 138-143.

65. FLAG-IDA in the treatment of refractory/relapsed acute myeloid leukemia: singlecenter experience / D. Pastore, G. Specchia, P. Carluccio et al. // Ann. Hematol. Vol.82, №4. - P.231-235.

66. Garcia, J.S. Blood consult: monosomal karyotype acute myeloid leukemia / J.S. Garcia, B.C. Medeiros, F.R. Appelbaum // Blood. - 2012. - Vol. 119, № 24. P.5659-5660.

67. German AML Cooperative Group (AMLCG). Chemomodulation of sequential highdose cytarabine by fludarabine in relapsed or refractory acute myeloid leukemia: a randomized trial of the AMLCG / M. Fiegl, M. Unterhalt, W. Kern et al. // Leukemia.

- 2014. - Vol.28, №5. - P.1001-1007.

68. Glasspool, R.M. Epigenetics as a mechanism driving polygenic clinical drug resistance / R.M. Glasspool, J.M. Teodoridis, R. Brown // Br. J. Cancer. - 2006. Vol. 94. - P.1087-1092.

69. Gore, S.D. In vitro basis for treatment with hypomethylating agents and histone deacetylase inhibitors: can epigenetic changes be used to monitor treatment / S.D. Gore // Leukemia Res. - 2009. - Vol.33 (suppl. 2). - P.2-6.

70. Hematopoietic cell transplantation (HCT)-specific comorbidity index: a new tool for risk assessment before allogeneic HCT / M.L. Sorror, M.B. Maris, R. Storb et al. // Blood. - 2005. - Vol.106, №8. - P.2912-2919.

71. Herbst, C. Meta-analysis on hypomethylating agents in myelodysplastic syndromes / C. Herbst, K. Bauer, K. Kreuzer // Haematologica. - 2010. - Vol. 95. - P. 342-343.

72. Herman, J.G. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation / J.G. Herman, S. B. Baylin // N. Engl. J. Med. - 2003. - Vol. 349.

- P.2042-2054.

73. Homoharringtonine in combination with cytarabine and aclarubicin in the treatment of refractory/relapsed acute myeloid leukemia: a single-center experience / W. Yu, L. Mao, J. Qian et al. // Ann. Hematol. - 2013. - Vol.92, №8. - P.1091-1100.

74. How I treat refractory and early relapsed acute myeloid leukemia / F. Tho, R.F. Schlenk, M. Heuser, A. Ganser // Blood. - 2015. - Vol.126, №3. - P.319-332.

75. Identification of hypermethylated genes associated wich cisplatin resistance in human cancers / X. Chang, C.L. Monitto, S. Demokan et al. // Cancer Res. - 2010. Vol. 70. - P. 2870-2879.

76. Imbalance of deoxyribonucleoside triphosphates, DNA double-strand breaks, and cell death caused by 2-chlorodeoxyadenosine in mouse FM3A cells / Y. Hirota, A. Yoshioka, S. Tanaka et al. // Cancer Res. -1989. - Vol.49, №4. - P. 915-919.

77. Increasing the dose of aclarubicin in low-dose cytarabine and aclarubicin in combination with granulocyte colony-stimulating factor (CAG regimen) can safely and effectively treat relapsed or refractory acute myeloid leukemia / L. Liu, Y. Zhang, Z. Jin et al. // Int. J. Hematol. - 2014. - Vol.99, №5. - P.603-608.

78. Interaction of 2-halogenated dATP analogs (F, Cl, and Br) with human DNA polymerases, DNA primase, and ribonucleotide reductase / W.B. Parker, A.R. Bapat, J.X. Shen et al. // Mol. Pharmacol. -1988. - Vol.34, №4. - P.485-491.

79. International Working Group for Diagnosis, Standardization of Response Criteria, Treatment Outcomes, and Reporting Standards for Therapeutic Trials in Acute Myeloid Leukemia. Revised recommendations of the International Working Group for Diagnosis, Standardization of Response Criteria, Treatment Outcomes, and Reporting Standards for Therapeutic Trials in Acute Myeloid Leukemia / B.D. Cheson, J.M. Bennett, K.J. Kopecky et al // J. Clin. Oncol. -2004. -Vol.22, №3. - P.576.

80. Issa, J.P. Epigenetic changes in the myelodysplastic syndrome / J.P. Issa // Hematol.

Oncol. Clin. N. Am. - 2010. - Vol.24. - P.317-330.

81. Issa, J.P. CpG island methylator phenotype in cancer / J.P. Issa // Nat. Rev. Cancer.

– 2004. - Vol. 4, №12. - P. 988–993.

82. Jones, P.A. The fundamental role of epigenetic events in cancer / P.A. Jones, S.B.

Baylin // Nat. Rev. Genet. - 2002. - Vol.3. - P.415-428.

83. Mangan, J.K. Salvage therapy for relapsed or refractory acute myeloid leukemia./ J.K. Mangan, S.M. Luger // Ther. Adv. Hematol. - 2011. - Vol.2, N2. - P.73-82.

84. Methylation of p15 and p16 genes in adult acute leukemia. Lack of prognostic significance / C.S. Chim, C.Y.Y. Tam, R. Liang, Y.L. Kwong // Cancer. - 2001. Vol.91. - P. 2222-2229.

85. Methylation of the p15INK4B gene in myelodysplastic syndrome: it can be detected early at diagnosis or during disease progression and is highly associated with leukemic transformation / H-F. Tien, J-L. Tang, W. Tsay et al. // Br. J. Hematol. Vol.112. - P.148-154.

86. Methylation of the p15INK4b gene in myelodysplastic syndromes is frequent and acquired during disease progression / B. Quesnel, G. Guillerm, R. Vereecque et al. // Blood. - 1998. - Vol.91. - P.2985-2990.

87. Methylation profiling in acute myeloid leukemia / M. Toyota, K.J. Kopecky, M.O. Toyota et al. // Blood. - 2001. - Vol.97. - P.2823-2829.

88. Monosomal karyotype in acute myeloid leukemia predicts adverse treatment outcome and associates with high functional multidrug resistance activity / H.K. Ahn, J.H. Jang, K. Kim et al. // Am J. Hematol. - 2012. - Vol. 87, №1. -P.37-41.

89. Monosomal karyotype in acute myeloid leukemia: a better indicator of poor prognosis than a complex karyotype. / D.A. Breems, W.L. Van Putten, G.E. de Greef et al. // J. Clin. Oncol. - 2008. - Vol.26, № 29. - P.4791-4797.

90. Monosomal karyotype in myelodysplastic syndromes, with or without monosomy 7 or 5, is prognostically worse than an otherwise complex karyotype / M.M. Patnaik, C.A. Hanson, J.M. Hodneeld et al. // Leukemia. - 2012. - Vol.25, №2. - P. 266Monosomal karyotype routinely defines a poor prognosis subgroup in acute myeloid leukemia and is frequently associated with TP53 deletion / J.B. Gaillard, J. Chiesa, D. Reboul et al. // Leuk. Lymphoma. -2012. -Vol. 53, №2. -P. 336-337.

92. Multicenter, phase II study of decitabine for the first-line treatment of older patients with acute myeloid leukemia / A.F. Cashen, G.J. Schiller, M.R. O’Donnell, G.F. DiPersio // J. Clin. Oncol. -2010. - Vol.28. - P.556-561.

93. Negative effect of DNA hypermethylation on the outcome of intensive chemotherapy in older patients with high-risk myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia following myelodysplastic syndrome / M. Grovdal, R. Khan, A. Aggerholm et al. // Clin. Cancer Res. - 2007. - Vol. 13. - P.7107-7112.

94. NCCN Cancer-related Fatigue Panel: National Comprehensive Cancer Network.

Clinical practice Guidelines in Oncology [Электронный ресурс]/ Distress Management Version 1, 2006 / www.nccn.org /.

95. Oral sapacitabine for the treatment of acute myeloid leukaemia in elderly patients: a randomised phase 2 study / H. Kantarjian, S. Faderl, G. Garcia-Manero et al. // Lancet Oncol. - 2013. - Vol.13, №11. - P.1096-1104.

96. Palliative chemotherapy followed by methylation inhibitor in high-risk acute myeloid leukemia: An in vitro and clinical study / B. Ding, Z. Wang, X. Jiang et al. // Mol. Clin. Oncol. - 2015. -Vol.3, №5. - P.1139-1144.

97. Pharmacokinetic evaluation of decitabine for the treatment of leukemia / J. Bryan, H. Kantarjian, G. Garcia-Manero, E. Jabbour // Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. Vol. 7. - P. 661-672.

98. Phase 1 study of low-dose prolonged exposure schedules of the hypomethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (decitabine) in hematopoietic malignancies / J.P. Issa, G. Garcia-Manero, F.J. Giles et al. // Blood. - 2004.- Vol. 103. - P.1635-1640.

99. Polish Adult Leukemia Group. Cladribine combined with high doses of arabinoside cytosine, mitoxantrone, and G-CSF (CLAG-M) is a highly effective salvage regimen in patients with refractory and relapsed acute myeloid leukemia of the poor risk: a final report of the Polish Adult Leukemia Group / A. Wierzbowska, T. Robak, A. Pluta et al. // Eur. J. Haematol. - 2008. - Vol.80, №2. - P.115-126.

100. Potential cure of acute myeloid leukemia / M. Yanada, G. Garcia-Manero, G. Borthakur et al. // Cancer. - 2007. - Vol.110, №12. - P.2756-2760.

101. Predictive value of pretreatment risk group and baseline LDH levels in MDS patients receiving azacitidine treatment / J.H. Moon, S.N. Kim, B.W. Kang et al. // Ann. Hematol. - 2010. - Vol. 89. - P.681-689.

102. Prognostic factors for response and overall survival in 282 patients with higher-risk myelodysplastic syndromes treated with azacitidine / R. Itzykson, S. Thpot, B. Quesnel et al. // Blood. - 2011. - Vol. 117. - P.403-411.

103. Prognostic impact of the number of methylated genes in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias treated with azacytidine / M.Abaigar, F. Ramos, R. Benito et al. // Ann. Hematol. - 2013. - Vol.92, № 11. - P.1543–1552.

104. Prognostic impact of monosomal karyotype in young adult and elderly acute myeloid leukemia: the Southwest Oncology Group (SWOG) experience / B.C. Medeiros, M. Othus, M. Fang et al. // Blood. - 2010. - Vol.116, №13. P. 2224-2228.

105. Prognostic index for adult patients with acute myeloid leukemia in first relapse / D.A. Breems, W.L. Van Putten, P.C. Huijgens et al. // J. Clin. Oncol. - 2005. Vol.23, № 9. - P.1969-1978.

106. Progressive chromatin repression and promoter methylation of CTNNA 1 associated with advanced myeloid malignancies / Y. Ye, M.A. McDevitt, M. Guo et al. // Cancer Res. - 2009. - Vol.69. - P.8482-8490.

107. Promoter hypermethylation analysis in myelodysplastic syndromes: Diagnostic & prognostic implication / P.R. Solomon, A.K. Munirajan, N. Tsuchida et al. // Indian J.

Med. Res. - 2008. - Vol.127. - P.52-57.

108. Promoter hypermethylation of p15INK4B, HIC1, CDH1 and ER is frequent in myelodysplastic syndrome and predicts poor prognosis in early-stage patients / A. Aggerholm, M.S. Holm, P. Guldberg et al. // Eur. J. Haematol. -2006. - Vol.76, № 1. - P.23-32.

109. Prospective evaluation of allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation from matched related and matched unrelated donors in younger adults with high-risk acute myeloid leukemia: German-Austrian trial AMLHD98A / R.F. Schlenk, K. Dohner, S. Mack et al. // J. Clin. Oncol. - 2010. - Vol.28, № 30. - P. 4642-4648.

110. Raj, K. Azacytidine (Vidaza) in the treatment of myelodysplastic syndromes / K. Raj, G.J. Mufti // Ther. Clin. Risk. Manag. - 2006. - Vol. 2. - P.377-388.

111. Randomized controlled trial of azacitidine in patients with the myelodysplastic syndrome: a study of the Cancer and Leukemia Group / L.R. Silverman, E.P. Demakos, B.L. Peterson et al. // B. J. Clin. Oncol. - 2002. - Vol.20. - P.2429– 2440.

112. Rapid loss of response after withdrawal of theatment with azacitidine: a case series in patients with higher-risk myelodysplastic syndromes or chronic myelomonocytic leukemia / M.T. Voso, M. Breccia, M. Lunghi et al. // Eur. J. Haematol. - 2013. Vol. 90, №4. - P. 345-348.

113. Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials / D. Grimwade, R.K. Hills, A.V. Moorman et al. // Blood. - 2010. - Vol. 116, № 3. - P.354-365.

114. Report of a phase 1/2 study of a combination of azacitidine and cytarabine in acute myelogenous leukemia and high-risk myelodysplastic syndromes / G. Borthakur, X. Huang, H. Kantarjian et al. // Leuk. Lymphoma. - 2010. - Vol.51, № 1. P.73-78.

115. Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes / P.L. Greenberg, H. Tuechler, J. Schanz et al. // Blood. - 2012. - Vol. 120, №12. P.2454-2465.

116. Revisiting the role of cladribine in acute myeloid leukemia: an improvement on past accomplishments or more old news? / C.W. Freyer, N. Gupta, M. Wetzler, E.S. Wang // Am J. Hematol. - 2015. - Vol. 90, №1. - P. 62-72.

117. Resistance prediction in AML: analysis of 4,601 patients from MRC/NCRI, HOVON/SAKK, SWOG, and MD Anderson Cancer Center / R.B. Walter, M. Othus, A.K. Burnett et al. // Leukemia - 2015. - Vol.29, №2. - P.312-320.

118. Results of a randomized study of 3 schedules of low-dose decitabine in higher-risk myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia / H. Kantarjian, Y. Oki, G. Garcia-Manero et al. // Blood. - 2007. -Vol. 109. - P. 52-57.

119. Saba, H.I. Decitabine in the treatment of myelodysplastic syndromes / H.I. Saba // Ther. Clin. Risk Manag. - 2007. - Vol.3. - P.807-817.

120. Saunthararajah, Y. Key clinical observations after 5-azacytidine and decitabine treatment of myelodysplastic syndromes suggest practical solutions for better outcomes / Y. Saunthararajah // Hematology (Am Soc. Hematol. Educ. Program). P.511-521.

121. Schlenk, R.F Genomic applications in the clinic: use in treatment paradigm of acute myeloid leukemia / R.F Schlenk, H. Dohner // Hematology (Am Soc. Hematol.

Educ. Program). - 2013. -P.324-330.

122. Sekeres, M.A. The epidemiology of myelodysplastic syndromes / M.A. Sekeres // Hematol. Oncol. Clin. N. Am. - 2010. - Vol.24. - P.287-294.

123. Shimamoto, T. Methylation of p15INK4b and E-cadherin genes is independently correlated wich poor prognosis in acute myeloid leukemia / T. Shimamoto, J.H. Ohyashiki, K. Ohyashiki // Leuk. Res. - 2005. - Vol.29. - P.653-659.

124. Sequential combination of decitabine and idarubicin synergistically enhances antileukemia effect followed by demethylating Wnt pathway inhibitor promoters and downregulating Wnt pathway nuclear target / K. Li, C. Hu, C. Mei et al. // J. Transl.

Med. - 2014. - Vol.12. - P.167.

125. Sequential treatment with cytarabine and decitabine has an increased anti-leukemia effect compared to cytarabine alone in xenograft models of childhood acute myeloid leukemia / S.M. Leonard, T. Perry, C.B. Woodman, P. Kearns // PLoS One. - 2014.

- Vol.9, №1. - E.87475.

126. Steensma, D. P. Multicenter study of decitabine administered daily for 5 days every 4 weeks to adults with myelodysplastic syndromes: the alternative dosing for outpatient treatment (ADOPT) trial / D. P. Steensma, M.R. Baer, J.L. Slack // J. Clin. Oncol. - 2009. - Vol.27. - P.3842-3848.

127. Tallman, M.S. Drug therapy for acute myeloid leukemia / M.S. Tallman, G. Gilliland, J.M. Rowe // Blood. - 2008. - Vol.106, №4. - P.1154-1163.

128. The C/EBPdelta tumor suppressor is silenced by hypermethylation in acute myeloid leukemia / S. Agrawal, W.K. Hoffman, N. Tidow et al. // Blood. -2007. Vol. 109, № 9. - P. 3895-3905.

129. The Medical Research Council Adult and Children’s Leukaemia Working Parties.

The importance of diagnostic cytogenetics on outcome in AML: analysis of 1,612 patients entered into the MRC AML 10 trial / D. Grimwade, H. Walker, F. Oliver et al. // Blood. - 1998. - Vol.92, №7. - P.2322-2333.

130. The Wnt/beta-catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells in AML / Y. Wang, A.V. Krivtsov, A.U. Sinha et al. // Science. – 2010. Vol. 327, №5973. - P.1650-1653.

131. The 2008 revision of the World health Organisation (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute myeloid leukemia: rationale and important changes / J.W. Vardiman, J. Thiele, D.A. Arber et al. // Blood. - 2008. - Vol.114, №5. P.937-951.

132. Time from diagnosis to intensive chemotherapy initiation does not adversely impact the outcome of patients with acute myeloid leukemia / S. Bertoli, E. Berard, F. Huguet et al. // Blood. - 2013. - Vol.121, №14. - P. 2618-2626.

133. Time from diagnosis to treatment initiation predicts survival in younger, but not older, acute myeloid leukemia patients / M.A. Sekeres, P.Elson, M.E. Kalaycio et al.

// Blood. - 2009. - Vol.113, №1. - P.28-36.

134. TP53 alterations in acute myeloid leukemia with complex karyotype correlate with specic copy number alterations, monosomal karyotype, and dismal outcome / F.G.

Rucker, R.F. Schlenk, L. Bullinger et al. // Blood. - 2012. -Vol.119, №9. P.2114-2121.

135. Transplantation of marrow cells from unrelated donors for treatment of high-risk acute leukemia: the effect of leukemic burden, donor HLA-matching, and marrow cell dos / J. Sierra, B. Storer, J.A. Hansen et al. // Blood. - 1997. - Vol.89, №11. P.4226-4235.

136. Twice-daily fludarabine and cytarabine combination with or without gentuzumab ozogamicin is effective in patients with relapsed/refractory acute myeloid leukemia, high-risk myelodysplastic syndrome, and blast- phase chronic myeloid leukemia / E.

Jabbour, G. Garcia-Manero, J. Cortes et al. // Clin. Lymphoma Myeloma Leuk. Vol. 12, № 4. - P. 244-251.

137. Update of the decitabine experience in higher risk myelodysplastic syndrome and analysis of prognostic factors associated with outcome / H.M. Kantarjian, S. O’Brien, J. Shan et al. // Cancer. -2007. - Vol. 109, №2. - P.265-273.

138. When azanucleoside treatment can be curative: nonintensive bridging strategy before allografting in older patients with myelodysplastic syndrome/acute myeloid leukemia / M. Lubbert, H. Bertz, M.J. Muller, J. Finke // J. Clin. Oncol. - 2013. Vol. 31, № 6. - P.822-823.

139. Zeidan, A.M. Higher-risk myelodysplastic syndromes with del(5q): is sequential azacitidine-lenalidomide combination the way to go? / A.M. Zeidan, S.D. Gore, R.S.

Komrokji // Expert Rev. Hematol. - 2013. - Vol.6, №3. - P.251-254.

140. 5-Azacitidine prolongs overall survival in patients with myelodysplastic syndrome a systematic review and meta-analysis / R. Gurion, L. Vidal, A. Gafter-Gvili et al. // Haematologica. - 2010. - Vol. 95. - P.303-310.



Похожие работы:

«У ДК 631.48 Л. В. Моторина, А. И. Савич, Н. П. Васильева, Н. А. Новикова Биологическая рекультивация отвалов с сульфиды держащими породами в Подмосковном угольном бассейне В практике рекультивации земель одним из наиболее труд­ ных объектов являются отвалы, сложенные породами с резко выраженными фитотоксичными свойствами, в частности суль­ ф...»

«ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ № 006/04 дезинфицирующего средства "Амоцид" производства фирмы "Лизоформ Др. Ханс Роземанн ГмбХ", Германия по лицензии фирмы "Лизоформ Дезинфекшн АГ", Швейцария для дезинфекции поверхностей, биологических выделений. Москва 2004 г. Инструкция по приме...»

«356 Вестник Чувашского университета. 2014. № 2 11. Hunt G.E., Cleary M., Walter G. Psychiatry and the Hirsch h-index: The relationship between journal impact factors and accrued citations / Harv Rev. Psychiatry. 2010. Vol. 18, № 4, Jul.-Aug. P. 207– 219. doi: 10.3109/10673229.2010.493742.12. Kul...»

«Естественные науки 23. Фадеева Е. О. Экология грача (Corvus frugilegus L.) в антропогенных ландшафтах ОкскоДонского междуречья. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2007. 200 с.24. Emery N. J. Cognitive ornithology: the evolut...»

«Хохлова Т. Ю. Межвидовая конкуренция среди вторичных дуплогнездников в условиях резких межгодовых перепадов весенних температур в Карелии // Принципы экологии. 2014. № 3. С. 49–65. DOI: 10.15393/j1.art.2014.3761 научный электронный журнал ПРИНЦИПЫ ЭКОЛОГИИ http://ecopri.ru htt...»

«  15.05.2001. Бюл. №4.4. Сторчак С.О. Пат. 62168 UA, МКІ Е21С41/06. Спосіб розробки крутоспадних родовищ корисних копалин/ С.О.Сторчак, В.О.Щелканов, Ф.І.Караманіц, Б.М.Андрєєв, В.А.Корж, С.В.Письменний (Україна); Заявл. 02.01.2003; Опубл. 15.12.2003; Бюл. № 12.5. Слесарев В.Д. Механика горных поро...»

«BCC Invest 3 марта 2017 г. Обзор рынка на 03.03.2017 г. Рынок: KASE Несмотря на слабый внешний фон и 1 587.53 0.44% Индекс KASE ослабление национальной валюты 1 237.7 313.6 Объем сделок, в тыс. usd казахстанский фондовый индекс 47 747.6 168.14 Капитализация в млн. KZT продемонстрировал умеренный рост на...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЗАКОН ОБ ОБРАЗОВАНИИ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Принят Государственной Думой 21 декабря 2012 года Одобрен Советом Федерации 26 декабря 2012 года Спи...»

«ГАЙДАШЕВА Ирина Игоревна КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ШТАММА STREPTOMYCES LATERITIUS 19/97 M: ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва –...»

«ТЕМА 7. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СТРУКТУРЫ АБСОЛЮТА (СЛОВА) 7.1. Общая характеристика сходств и различий генетического кода и естественного языка.7.2. Структурный изоморфизм генетического кода и естественного языка.7.3. Структ...»

«МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОСГИДРОМЕТ Федеральное государственное бюджетное учреждение "ПРИВОЛЖСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ ПО ГИДРОМЕТЕОРОЛОГИИ И МОНИТОРИНГУ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ" (ФГБУ "Приволжское УГМС") ЭКОЛ...»

«Электронный научный журнал "Вестник Омского государственного педагогического университета" Выпуск 2006 www.omsk.edu И.И. Богданов Омский государственный педагогический университет Иксодовые клещи Западной Сибири. Сообщение VII. Типы населения иксодовых клещей 03.00.08 – зоология Индикатором условий существования возбудителя является тип населения...»

«BWC/CONF.VII/INF.7 Седьмая Конференция государств участников 10 October 2011 Конвенции о запрещении разработки, Russian Original: English производства и накопления запасов бактериологического (биологического) и токсинного оружия и об и...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт нера...»

«RU 2 356 796 C1 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК B64C 30/00 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2007145010/11, 03.12.2007 (72) Автор(ы): Чиркашенко Владимир Федорович (RU), (24...»

«Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2013. № 6(107) УДК 579.8.017.73 ДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК GALLERIA MELLONELLA НА АКТИВНОСТЬ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ E. COLI Е.Г. Литвинова2 c 2...»

«Вестник Томского государственного университета. Биология. 2012. № 4 (20). С. 68–76 БОТАНИКА УДК 581.2, 581.6 Т.Н. Беляева1, А.Н. Бутенкова2, Ю.А. Чикин2, О.А. Гайворонских2 Сибирский ботанический сад Томского государственного университета (г....»

«Электронный архив УГЛТУ УДК 316.344.233 ГРНТИ 03.23.55 И.В. Назаров УГЛТУ, Екатеринбург ПОРОК БЕДНОСТИ В "БОГАТОЙ" СТРАНЕ В статье рассматривается проблема бедности большинства населения в России. Анализируются ее причины и пути сокращения. Приводятся статистические данные процента бедности...»

«Шкабара Наталья Александровна ЭКОЛОГО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПОКРЫТИЯ БАРЬЕРНОГО ТИПА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ КОРРОЗИИ И МОРСКОГО ОБРАСТАНИЯ НЕФТЕГАЗОПРОВОДОВ, ПЛАВУЧИХ СРЕДСТВ И ПОРТОВЫХ СООРУЖЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ ГЕЛЕНДЖИКСКОЙ БУХТЫ) Специальность: 03.02.08 – Экология (технические науки) (в нефтегазовой отрасли...»

«Ремедиум, 2010, N 5 ЧТО ДОЗВОЛЕНО РЕКЛАМЕ БАД: ЕВРОПЕЙСКИЙ ОПЫТ В настоящее время внимание специалистов на европейском фармацевтическом и смежных рынках приковано к усилиям регуляторных органов по оценке рекламных утверждений, касающихся продуктов питания, в том числе биологически активных добавок к пище. Согласно действующему законодательству ЕС...»








 
2017 www.net.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.