WWW.NET.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Интернет ресурсы
 

Pages:   || 2 |

«БОБЫЛЁВА Полина Ивановна ВЛИЯНИЕ АЛЛОГЕННЫХ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ 03.03.01 - ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Государственный научный центр Российской Федерации –

Институт медико-биологических проблем

Российской академии наук

_________________________

На правах рукописи

БОБЫЛЁВА

Полина Ивановна

ВЛИЯНИЕ АЛЛОГЕННЫХ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ

СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

03.03.01 - Физиология 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна кандидат биологических наук Андреева Елена Ромуальдовна Москва – 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ………………. 5 ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………….. 7 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………… 14 Основные характеристики мультипотентных мезенхимных 1.1 стромальных клеток (МСК)………………………………………… 14 История исследования малодифференцированных стромальных 1.1.1 предшественников взрослого организма………………………….. 14 Критерии МСК……………………………………………………… 1.1.2 16 Тканевые источники МСК………………………………………….

1.1.3 17 МСК из жировой ткани……………………………………………...



1.1.4 19 Участие МСК в регенеративных процессах……………………….

1.1.5 23 МСК в клеточной терапии и регенеративной медицине………… 1.1.6 25 Содержание кислорода как фактор микроокружения МСК……...

1.2 27 Молекулярный механизм ответа МСК на пониженную 1.2.1 концентрацию О2…………………………………………………… 29 Изменение свойств МСК при гипоксических значениях 1.2.2 концентрации О2……………………………………………………. 30 Морфология и иммунофенотип…………………………………….

1.2.2.1

–  –  –

йодид пропидия PI фактор стволовых клеток SCF фактор стромальных клеток SDF Т-хелперы Th васкулярная молекула клеточной адгезии VCAM фактор роста эндотелия сосудов VEGF

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень изученности темы Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) во взрослом организме представляют собой гетерогенную популяцию стромальных предшественников, способных к мультилинейной дифференцировке, в частности, в остеогенном, адипогенном, хондрогенном направлениях (Friedenstein et al., 1970; Caplan, 1991; Pittenger et al., 1999; Horwitz et al., 2005; Dominici et al., 2006). МСК являются резидентами многих тканей организма (Паюшина и др., 2006, 2009; Буравкова и др., 2012;

Pountos et al., 2005; Ylstalo et al., 2013). В их функции входит участие в физиологическом и репаративном замещении тканей, формировании стромы и поддержании гемопоэза (Baksh et al., 2004; Hofmeister et al., 2007; Caplan 2009, 2015; Ma et al., 2014).

Участие МСК в процессах регенерации осуществляется за счт способности мигрировать в зону повреждения, приживляться, продуцировать широкий спектр цитокинов, оказывая иммунорегуляторное и «трофическое» действие, синтезировать компоненты внеклеточного матрикса и дифференцироваться в различных направлениях (Парфенова и др., 2009; Калинина и др., 2011; Андреева, Буравкова, 2012; Буравкова и др., 2012; Сабурина и др., 2013; Caplan, 2007, 2009; Nauta and Fibbe, 2007; Franois et al., 2012;





Bernardo and Fibbe, 2013; Law et al., 2013; Patel et al, 2013; Prockop, 2013). Наличие у МСК набора перечисленных свойств дат основание рассматривать их как перспективный инструмент регенеративной медицины. К настоящему моменту проведн ряд доклинических и клинических исследований, свидетельствующих о благоприятном эффекте от трансплантации МСК (Шумаков и др., 2003; Фатхутдинов и др., 2005;

Андреева и др., 2009; Мелихова и др., 2009; Дробышев и др., 2011; Орлов и др., 2011;

Силачв и др., 2015; Ankrum et al., 2014; Farini et al., 2014; Squillaro et al., 2015).

Особую роль играют свойства МСК, связанные с взаимодействием с иммунной системой. Благодаря низкой экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса, МСК мало заметны для Т-клеточного звена иммунной системы и вследствие этого обладают низкой иммуногенностью (Le Blanc et al., 2003; Ankrum et al., 2014). Под воздействием провоспалительных факторов, выделяемых активированными иммунными клетками, происходит «праймирование» МСК: они приобретают свойства, позволяющие за счт выделения набора растворимых молекул (индоламиндиоксигеназа (ИДО), простогландин Е2 (ПГЕ2), оксид азота NO и др.), микровезикул и экспрессии поверхностных антигенов (CD9, CD106, CD44 и др.) осуществлять подавление иммунной реакции, таким образом выполняя регуляторную роль (Рубцов и др., 2009; Горностаева и др., 2013; Miyake et al., 1990, 1991; Oritani et al., 1996; Aoyama et al., 1999; Di Nicola et al., 2002; Ma et al., 2013; Bruno et al., 2015). Иммуномодуляторные свойства МСК могут быть использованы для терапии аутоиммунных заболеваний и при трансплантации органов.

Сочетание низкой иммуногенности и иммуносупрессии позволяет МСК избегать иммунного ответа, снижая при этом риск элиминации введнных реципиенту аллогенных МСК.

К настоящему моменту достаточно подробно изучен вопрос об активации иммуномодуляторного действия МСК в присутствии провоспалительных стимулов (интерферона-гамма (ИФН-гамма), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа) и других провоспалительных цитокинов, активированных лимфоцитов) (см. обзоры Рубцов и др., 2009; Nauta, Fibbe, 2007, Ghannam et al., 2010, Hoogduijn et al., 2010). В нашей лаборатории проведены исследования, демонстрирующие иммуносупрессивный эффект МСК в отношении ФГА-активированных МНК периферической крови при атмосферном и пониженном содержании О2 (Андреева и др., 2011; Горностаева и др., 2011, 2012, 2013). В то же время довольно мало известно о воздействии иммунных клеток и продуцируемых ими факторов на те свойства МСК, которые непосредственно связаны с выполнением регенеративной функции. Для более глубокого понимания процессов, происходящих при взаимодействии МСК и иммунных клеток, важно определить вклад паракринных факторов и непосредственных межклеточных контактов в регуляцию функций МСК.

Следует также отметить, что взаимодействие МСК с иммунными клетками в зависимости от способа введения (локально в ткани или системно в кровоток) может происходить в условиях большей или меньшей оксигенации. Убедительно продемонстрировано влияние этого фактора на ряд свойств МСК, в т.ч. на энергетический метаболизм, пролиферативную, дифференцировочную, паракринную активность (Буравкова и др., 2012; Lavrentieva et al., 2013; Ejtehadifar et al. 2015). Предположительно, значение данного параметра может отразиться на межклеточном взаимодействии, в которое вовлечены МСК и иммунные клетки (Буравкова и др., 2012).

Исследование влияния на МСК аллогенных иммунных клеток в среде с изменнным газовым составом (пониженным содержанием О2) позволит выяснить, как в условиях, приближенных к физиологическим, под воздействием паракринных факторов и контактного взаимодействия изменится состояние МСК и их свойства, которые могут быть востребованы в репаративных процессах. Полученные в ходе исследования данные должны дополнить фундаментальные представления о механизмах вовлечения МСК в физиологические процессы восстановления и заживления, а также способствовать развитию прикладных аспектов клеточной физиологии.

Цель и задачи исследования Цель работы: изучение функциональных характеристик МСК при взаимодействии с иммунными клетками в условиях тканевого содержания О2.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи - после взаимодействия с активированными аллогенными мононуклеарами периферической крови (МНК) при атмосферной (20%) и пониженной до физиологических значений (5%) концентраций О2:

1) охарактеризовать изменение жизнеспособности, иммунофенотипа, экспрессии молекул адгезии, состояния клеточных органелл и продукции активных форм кислорода (АФК);

2) оценить пролиферативную активность, дифференцировочный потенциал и способность к миграции МСК;

3) оценить вклад паракринной регуляции и контактного межклеточного взаимодействия в реализацию свойств МСК;

4) проанализировать дифференциальную экспрессию генов МСК.

Научная новизна Впервые проведена комплексная оценка изменения состояния МСК и их функционального потенциала при взаимодействии с аллогенными активированными мононуклеарами периферической крови in vitro. Получены новые данные по влиянию атмосферной и тканевой концентрации О2 на свойства МСК в условиях взаимодействия с МНК.

Впервые показано, что при тканевом значении концентрации О 2 под воздействием активированных аллогенных МНК снижается пролиферативная, дифференцировочная, миграционная активность МСК, увеличивается экспрессия молекул адгезии, снижается продукция провоспалительных факторов и увеличивается - проангиогенных, изменяется транскрипционная активность большого количества генов, ответственных за сигналинг, пролиферацию, дифференцировку, клеточную гибель, иммунный ответ, клеточную адгезию, миграцию, транскрипцию, катаболизм, хемотаксис, организацию и биогенез органелл и цитоскелета и др.

Выраженность изменений ряда свойств МСК зависит от концентрации О 2, в их числе активность органелл, остеодифференцировка, миграция. Обнаружено, что при атмосферном (20%) содержании О2 МСК более чувствительны к воздействию активированных МНК, что проявляется уже на транскрипционном уровне.

Впервые показано, что подавление пролиферации и остеодифференцировки МСК в присутствии МНК происходит только при прямом клеточном контакте, однако изменение активности органелл, способности к адиподифференцировке, миграционной, паракринной активности, экспрессии молекул адгезии имеет место как при паракринном, так и при прямом контакте «клетка-клетка».

Установлено, что на МСК влияют не только внешние факторы, такие как концентрация О2, но и внутренние, такие как состояние внутриклеточных компартментов.

Впервые показано, что с различиями в уровне эндогенных АФК в МСК могут быть связаны особенности их реакции на взаимодействие с иммунными клетками: МСК с исходно низким уровнем АФК менее подвержены повреждающему воздействию со стороны активированных МНК, чем МСК с высоким содержанием АФК, что проявляется в снижении жизнеспособности МСК и выраженном изменении состояния клеточных компартментов.

Теоретическая и практическая значимость работы Данные, полученные в результате оценки взаимодействия между МСК и МНК, помогают лучше понять фундаментальные механизмы реализации свойств этих клеток при двунаправленных воздействиях МНК-МСК в рамках динамического процесса, который постоянно происходит в тканях. Полученные данные свидетельствуют о значимости внешних (концентрация О2) и внутренних (уровень АФК) факторов для регуляции ответа МСК на стимулы МНК. Взаимодействие с МНК приводит к изменениям внутреннего состояния МСК, затрагивающим транскрипционную активность широкого спектра генов, функционирование различных органелл, что приводит к изменению функциональной активности МСК. Результаты данного исследования демонстрируют вклад паракринных механизмов в регуляцию функций МСК и существенном воздействии непосредственных контактов с активированными МНК.

Полученные результаты существенно расширяют представления о том, как в условиях, приближенных к физиологическим, под воздействием аллогенных иммунных клеток модифицируются свойства МСК, значимые для реализации регенеративного потенциала. Установлено, что контактное и паракринное взаимодействие с аллогенными активированными МНК при атмосферном и тканевом значениях О2 вызывают изменения в МСК, затрагивающие их внутреннее состояние (активность органелл), а также ряд функциональных свойств, которые востребованы в регенеративных процессах (пролиферативная, дифференцировочная, миграционная, паракринная активность, экспрессия молекул адгезии). В целом, при 20% и 5% О2 свойства МСК изменяются сходным образом, но при повышенном по сравнению с тканевым значением О 2 МСК более чувствительны к действию иммунных клеток. Это следует принять во внимание при разработке модельных систем и систем для культивирования и экспансии МСК для медицинских целей. Обнаруженные различия в реакции МСК на воздействие МНК в зависимости от исходных свойств (уровня АФК) первых говорят о важности создания подхода для подбора и тестирования клеток, которые в дальнейшем планируется использовать для нужд регенеративной медицины. Поскольку МСК с высоким уровнем АФК проявляют большую чувствительность к аллогенным активированным МНК и подвержены цитотоксическому воздействию, это необходимо учитывать при подготовке МСК для протоколов клеточной терапии и регенеративной медицины.

Результаты данного исследования включены в курс лекций «Ткани внутренней среды» для студентов кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Методология и методы диссертационного исследования Исследование основано на ряде экспериментов по изучению взаимодействия МСК, выделенных из жировой ткани человека, с активированными аллогенными МНК периферической крови человека in vitro. Разработка экспериментальной модели и подбор условий осуществлялись на основе проанализированных литературных данных по соответствующей тематике, а также предшествующих экспериментов, проведнных в лаборатории, на базе которой осуществлялось исследование.

Для решения задач данной работы использовался следующий набор методов (более подробное описание – в Главе 2):

- выделение МСК из жировой ткани человека;

- выделение мононуклеаров из периферической крови человека;

- культивирование клеток, совместное культивирование;

- индукция остеогенной и адипогенной дифференцировки МСК;

- иммуноцитохимическое окрашивание;

- выявление различных органелл и АФК при помощи флуоресцентных зондов;

- анализ жизнеспособности после окрашивания аннексином V и йодидом пропидия;

- твердофазный иммуноферментный анализ;

- «метод раны» для оценки ненаправленной миграции МСК;

- оценка направленной миграции МСК с помощью модифицированной камеры Бойдена;

- световая микроскопия с применением фазового контраста;

- флуоресцентная микроскопия;

- конфокальная микроскопия;

- проточная цитофлуориметрия;

- оценка дифференциальной экспрессии генов с помощью микрочипов;

- статистический анализ.

Положения, выносимые на защиту

1. Изменения функциональной активности мультпотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) более выражены при непосредственном контакте c активированными аллогенными мононуклеарами периферической крови (МНК).

2. При концентрации О2, близкой к тканевой, МСК менее чувствительны к действию активированных аллогенных МНК, чем при атмосферном содержании О2.

3. Исходный уровень АФК в МСК может определять выраженность их ответа при взаимодействии с активированными аллогенными МНК.

Достоверность полученных результатов Достоверность результатов диссертационного исследования подтверждается достаточным количеством наблюдений, современными методами исследования, которые соответствуют поставленным в данной работе цели и задачам. Сформулированные в диссертационной работе научные положения и выводы подкреплены фактическими данными, которые наглядно представлены в графиках и таблицах, а также проиллюстрированы микрофотографиями. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием современных методов анализа данных.

Интерпретация результатов производилась на осонове анализа данных мировой научной литературы по соответствующей тематике.

Апробация работы Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на World Conference on Regenerative Medicine (Germany, Leipzig, 2013), V Всероссийской научно-практической конференции "Стволовые клетки и регенеративная медицина" (Москва, 2013), XII, XIII, XIV Конференции молодых учных, специалистов и студентов (Москва, 2013, 2014. 2015), IV Съезде физиологов СНГ (Сочи – Дагомыс, 2014), International Conference on Cell and Stem Cell Engineering (Italy, Rome, 2014), 5th World Congress on Cell & Stem Cell Research March (Chicago, Illinois, USA, 2015), 4th International Conference Stategies in Tissue Engineering (Germany, Wuerzburg, 2015), 2-ом Национальном Конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2015).

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ, 2 статьи в журналах из баз данных Web of Science, 1 статья в сборнике, 10 тезисов докладов.

Результаты диссертационной работы обсуждены на межлабораторном семинаре в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (протокол № 2 от 23.03.2016 г.).

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Интегративная физиология», гранта РФФИ 13-04-00793.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные характеристики мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) 1.1.1. История исследования малодифференцированных стромальных предшественников взрослого организма Основоположником современной концепции о мультипотентных стромальных предшественниках по праву считается А.Я. Фриденштейн. Но задолго до осуществления серии работ коллектива под его руководством исследователи пытались описать свойства и роль в организме клеток, являющихся компонентами стромы костного мозга. Обзор Prockop (1997) отсылает нас к исследованиям, которые проводились ещ XIX в. В 1867 г.

немецкий патолог J.F. Cohnheim опубликовал работу, в которой предположил, что фибробластоподобные клетки, участвующие в восстановлении повреждений, приходят из костного мозга. В это же время L.L. Ollier показал, что костный мозг является источником предшественников костных клеток. К 1869 г. Goujon в экспериментальной модели на животном впервые выполнил эктопическую трансплантацию костного мозга и показал образование кости, а уже в следующем году А. Байков в своей работе (Baikow A., ber Transplantation von Knochenmark) подтвердил эти результаты.

Чрезвычайно важную роль в развитии исследований в области стволовых клеток мезенхимного происхождения сыграли работы выдающегося отечественного гистолога А.А. Максимова, сформулировавшего теорию «мезенхимного резерва». В 1927 г. был опубликован его фундаментальный труд «Соединительная ткань и кроветворные ткани»

(нем. Bindegewebe und Blutbildendes Gewebe), где он высказал мнение о наличии в соединительных тканях взрослого организма клеток-предшественников, располагающихся вокруг мелких сосудов. Эти клетки он обозначал как стволовые мезенхимные клетки, вкладывая в это понятие не только их эмбриональное происхождение, но и дифференцировочные потенции, т.е. способность дифференцироваться во все виды соединительных тканей, например, при репаративном гистогенезе. Это направление продолжилось в работах выдающихся российских гистологов А.А. Заварзина, С.И.

Щелкунова, Н.Г. Хлопина. Было продемонстрировано, что малодифференцированные фибробласты (по Заварзину «камбиальные клетки»), лежащие в основном вблизи сосудов, участвуют в репаративном гистогенезе соединительной ткани, а также в физиологической регенерации (см. обзор Бозо и др., 2010). Позже были проведены эксперименты, демонстрирующие как то, что в репаративных процессах участвуют местные источники клеток-предшественников (Ross et al., 1970), так и участие в этом предшественников костномозгового происхождения (Хрущов, 1976; Oehmichen, 1973).

В 1961 г. А.Я. Фриденштейн выделил из костного мозга адгезирующие фибробластоподобные клоногенные клетки, которые были названы им колониеобразующими единицами фибробластов – КОЕ-Ф. In vitro эти клетки обладали высокой репликативной способностью (Фриденштейн и др., 1973; Friedenstein et al., 1968, 1970, 1974), а при трансплантации in vivo проявляли мультипотентность: КОЕ-Ф дифференцировались в остеобласты, хондроциты, адипоциты и клетки гемопоэтической стромы (Фриденштейн и др., 1968, 1986; Лурия и др., 1966; Friedenstein et al., 1966, 1968, 1974, 1980, 1987). А.Я. Фриденштейн в своих работах указывал на то, что в постнатальном периоде костный мозг является резервуаром стволовых клеток для тканей мезенхимального происхождения.

Многочисленные исследования продемонстрировали, что стромальные клетки, присутствующие в костном мозге, обладают потенциями к дифференцировке в различных направлениях. Danis (1960) (см. Dennis et al., 2007) с помощью имплантации животным диффузионных камер с костным мозгом показал, что клетки костного мозга обладают остеогенным потенциалом, а не являются лишь индуктивным фактором или хемоаттрактантом для остеогенных клеток. Другими исследовательскими группами (Petrakova et al., 1963; Friedenstein et al., 1966; Bruder et al., 1990) в сходных экспериментах установлено, что клетки костного мозга обладают потенциалом к образованию, по крайней мере, кости и хряща, а позже было обнаружено, что костный мозг содержит клетки различных мезенхимных линий (Owen, Friedenstein, 1988; Caplan, 1991, Dennis et al., 1996, 1999, 2002, Friedenstein, 1973; Friedenstein et al., 1987, Pittenger et al., 1999), и при особых условиях культивирования популяция клеток костного мозга экспрессирует дополнительные маркры эктодермальных и энтодермальных линий (Jiang et al., 2002).

В 1991 г. Caplan предложил термин «мезенхимные стволовые клетки» для обозначения стромальных предшественников, после чего аббревиатура МСК стала общеупотребительной. Говоря об эмбриональных МСК, он констатировал, что они являются мультипотентными предшественниками, способными многократно делиться, и потомки которых дают начало опорным тканям, среди которых хрящ, кость, связки, сухожилие, строма костного мозга, соединительная ткань; по определению, они не ограничиваются фиксированным числом митотических делений. В то же время он возлагал большие надежды на возможность использования собственных МСК взрослого организма для целенаправленной дифференцировки (in vitro) в клетки какой-либо линии в регенеративных целях, подчркивая, что МСК должны существовать для поддержания стромального дифферона, точно так же, как гемопоэтические стволовые клетки обеспечивают оборот красных и белых клеток крови (Caplan, 1991). В течение многих лет шли споры о стволовых характеристиках этих клеток, т.е. о способности их к самообновлению и асимметричному делению. В 1999 году Pittenger описал наличие в костном мозге человека 3-потентных адипогенных, остеогенных и хондрогенных клонов и охарактеризовал профиль их поверхностных антигенов с низкой экспрессией специфических маркров эндотелиальной и гемопоэтической линий дифференцировки.

Дальнейшие исследования показали, что МСК действительно отличаются от эндотелиальных и гемопоэтических прогениторных клеток (Delorme et al., 2008).

Стромальные клетки с мультипотентными свойствами в ходе исследований назывались по-разному. Фриденштейн определял их «КОЕ-ф» или «остеогенные предшественники» (Friedenstein et al., 1970), Owen использовал термин «стромальные костномозговые клетки» (Owen et al., 1987). Наиболее часто использовался термин Каплана «МСК», но в то же время Bianco и Robey предпочитали применять название «скелетные стволовые клетки», а Dennis называл их «мезенхимными клеткамипредшественниками» (Caplan, 1991; Dennis et al., 1999; Bianco et al., 2008). В 2006 году Международное Общество по Клеточной Терапии (Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy) предложило термин «мультипотентные мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК)», чтобы подчеркнуть стволовые и стромальные характеристики этих клеток (Dominici et al., 2006).

1.1.2. Критерии МСК Единого маркра для идентификации МСК до сих пор не обнаружено. Для установления того, является ли клетка МСК, проверяют наличие маркрных молекул, которые могут присутствовать и которые должны отсутствовать на МСК.

Международное Общество по Клеточной Терапии установили следующие критерии для определения мезенхимных стволовых/стромальных клеток (Dominici et al., 2006):

1. МСК должны быстро прикрепляться к пластику при стандартных условиях культивирования;

2. МСК должны иметь способность к остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировке;

3. МСК должны экспрессировать CD73, CD90 и CD105;

4. МСК не должны экспрессировать маркры гемопоэтических клеток c-kit, CD14, CD11b, CD34, CD45, CD19, CD79 и лейкоцитарный антиген человека HLA-DR.

Поскольку для МСК не было выявлено какого-то одного определнного маркра, в разных лабораториях используют для выделения этих клеток различные наборы антигенов (см. обзор Пулин и др., 2008). Наилучшим способом отделить от других клеток и получить популяцию МСК in vitro является адгезия их к пластику и дальнейшее культивирование (см. обзор Ylstalo et al., 2013).

1.1.3. Тканевые источники МСК Источником МСК может служить не только костный мозг, но и губчатая костная ткань, надкостница, гиалиновый хрящ, синовиальная мембрана, синовиальная жидкость, мышцы, жировая ткань, сухожилия, периферическая кровь, кровеносные сосуды, зародышевые ткани, кожа, селезнка, тимус, сосуды пуповины (см. обзор Pountos et al., 2005), пуповинная кровь, Вартонов студень, зародышевые ткани (см. обзор Ylstalo et al.,

2013) печень, амниотическая жидкость, плацента и пульпа зуба (см. обзор Giordano et al., 2007). Следует учесть, что МСК из разных тканей вс же не идентичны и могут отличаться по профилю экспрессии генов, поверхностных антигенов, дифференцировочному потенциалу in vitro и in vivo (Baksh et al., 2007; Bianco et al., 2008;

De Bari et al., 2008). Поэтому при описании результатов важно чтко обозначать источник, характеристики и условия культивирования МСК.

То, что из различных тканей были выделены малодифференцированные стромальные предшественники, сходные по своим свойствам, может указывать на существование в организме какого-то общего депо этих клеток. Возможным кандидатом на то, чтобы называться «депо МСК», могут быть кровеносные сосуды, а точнее стенки кровеносных сосудов. Da Silva Meirelles et al. (2008) обнаружили корреляцию между тем, насколько ткань обогащена сосудами, и количеством МСК, которые могут быть из не выделены.

Посредством ферментативной обработки тканей с хорошо развитой системой микроциркуляции можно получить так называемую стромально-васкулярную фракцию, в которой присутствуют периваскулярные или перицитоподобные клетки. Эти клетки окружают интиму сосудов, образуя непрерывную сеть в субэндотелиальном пространстве вдоль всего сосудистого русла – от магистральных артерий до капилляров (Andreeva et al., 1998). Они осуществляют регуляцию сократимости, стабильности и целостности сосудов, а также их роста, формирования и ремоделирования (Nehls et al., 1991; см. обзор Betsholtz et al., 2005; Armulik et al., 2005; von Tell et al., 2006). Кроме того известно, что по крайней мере часть из них является малодифференцированными стромальными предшественниками, способными дифференцироваться в клетки хряща, кости, жировой ткани (Farrington-Rock et al., 2004; Collett, Canfield, 2005). Маркрные молекулы перицитов были обнаружены на МСК из костного мозга, пульпы зуба человека (Shi, Gronthos, 2003), миометрия (Schwab, Gargett, 2007) и жировой ткани человека (Traktuev et al., 2008). МСК, выделенные из разных тканей человека, и перициты обладают сходным профилем экспрессии различных маркров, дифференцировочным и пролиферативным потенциалом и способны поддерживать гемопоэз (Covas et al., 2008; Crisan et al., 2008).

Одними из кандидатов на роль клеток со свойствами МСК являются адвентициальные клетки. Они находятся в адвентициальном слое сосудов, активно участвуют в ремоделировании сосудов, пролиферируя, мигрируя в медию и интиму и дифференцируясь в гладкомышечные клетки (Shi et al., 1996; Oparil et al., 1999).

Zheng et al. (2007) выделили небольшую популяцию так называемых миогенных эндотелиальных клеток из интимы микрососудов скелетной мышцы. Любопытно, что эти клетки экспрессируют не только маркр мышечной дифференцировки CD56, но также и эндотелиальные маркры CD34 и CD144. Выделенная популяция этих клеток in vitro поддатся клональной экспансии и дифференцировке в остеогенном, хондрогенном, адипогенном и миогенном направлениях, а также обладает более выраженной способностью к регенерации поврежднной скелетной мышцы, чем стандартные CD56+ миобласты. Но вс же ещ недостаточно очевидно, насколько эти клетки вносят вклад в формирование пула МСК.

До сих пор не установлен «МСКовый» фенотип in vivo, и нет тврдых доказательств in vivo их «стволовых» характеристик (см. обзор Ankrum et al., 2014). Хотя недавно у мышей были обнаружены ограниченные по линиям дифференцировки самообновляющиеся предшественники (костные, хрящевые, стромальные) и популяции Mx1+ стромальных клеток, детерминированных в остеогенном направлении (Park et al., 2012), не ясно, как они соотносятся с МСК. Действительно, методы выявления и характеристики МСК преимущественно основаны на работах in vitro. Несмотря на то, что у перицитов и МСК много общих черт, и возможно, что когда перициты активируются и покидают кровеносные сосуды, они дифференцируются в МСК, окончательно это не было доказано (обзор Ankrum et al., 2014). Однако есть факты, указывающие на то, что МСК берут начало от перицитов и адвентициальных клеток-предшественников практически из всех тканей (Crisan et al., 2012; James et al., 2012). И по мнению Caplan (2008) МСК на самом деле происходят от периваскулярных клеток, перицитов, а не от костномозговой стромы.

Приведнные данные позволяют предполагать, что во взрослом организме в дополнение к костному мозгу существуют депо малодифференцированных мезенхимных клеток периваскулярной локализации, которые обеспечивают пополнение стромальных клеточных пулов при физиологической и репаративной регенерации.

1.1.4. МСК из жировой ткани Жировая ткань сложно организована, состоит из разделнных тонкими прослойками рыхлой волокнистой соединительной ткани долек, в которых плотно упакованы адипоциты. Помимо зрелых адипоцитов и преадипоцитов, присутствуют фибробласты, гладкомышечные клетки сосудов, резидентные моноциты/макрофаги и лимфоциты.

В 1976 г. Van et al. и Dardick et al. независимо друг от друга выделили адгезирующие к пластику адипогенные предшественники из жировой ткани человека. Zuk et al. (2002) в дальнейшем показали, что стромально-васкулярная фракция жировой ткани – это источник мезенхимных предшественников (МСК). Однако сама стромально-васкулярная фракция, получаемая при ферментативной обработке жировой ткани, довольно гетерогенна по составу (Таблица 1.1).

–  –  –

МСК из жировой ткани in vitro определяются по тем же признакам, что и костномозговые: адгезия к пластику, дифференцировка в мезенхимных направлениях и соответствующий иммунофенотип (Zuk et al., 2002). На основании имеющихся данных International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) и International Society for cellular Therapy (ISCT) сформулировали ряд рекомендаций для характеристики МСК при выделении их из жировой ткани (Таблица 1.2).

Таблица 1.2.

Критерии для идентификации МСК из жировой ткани * Признак Критерий, которому соответствуют МСК жизнеспособность 90% иммунофнотип первичные маркры, стабильно экспрессирующиеся: CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (80% МСК);

первичные маркры, экспрессия не стабильная: CD34 (вариабельный уровень экспрессии);

первичные негативные маркры: CD31, CD45, CD235a (2%);

вторичные позитивные маркры: CD10, CD26, CD36, CD49d, CD49e;

вторичные слабо экспрессирующиеся/не экспрессирующиеся маркры: CD3, CD11b, CD49f, CD106, PODXL частота ожидаемый уровень 5% пролиферации адипогенная гистология: масляный красный О, нильский красный или др.

дифференциорвка специфические красители для липидных включений;

биомаркры: адипонектин, C/EBP, FABP4, лептин, PPAR хондрогенная гистология: альциановый синий, сафранин О;

дифференцировка биомаркры: аггрекан, коллаген II типа, Sox9 остеогенная гистология: ализариновый красный, окрашивание по фон Косса;

дифференцировка биомаркры: щелочная фосфотаза, костный сиалопротеин, остеокальцин, остерикс, runx2 *(по Bourin et al., 2013) В лаборатории B. Pault (см. обзор Chen et al. 2013) были получены данные о различных субпопуляциях предшественников МСК, выделенных из стромальноваскулярной фракции жировой ткани. Среди них перициты (CD146+/CD34-/CD45-) и адвентициальные клетки (CD34+/CD31-/CD45-/CD146-), которые in vivo и в культуре экспрессировали маркры МСК. Только треть перицитов исходно экспрессировала маркры МСК CD73, CD90 и CD105, что свидетельствует о гетерогенности внутри популяции этих клеток. Но все CD34+/CD31-/Lineage-/CD45- клетки: и CD146+ (возможные промежуточные формы между перицитами и адвентициальными клетками), и CD146адвентициальные) клетки – экспрессировали маркры МСК. На основании экспрессии

CD34 среди клеток стромально-васкулярной фракции можно выделить 2 популяции:

CD34- клетки с низкой пролиферативной активностью и CD34+ клетки с высокой пролиферативной активностью. Отсутствие экспрессии типично для CD34 мультипотентных мезенхимогенных перицитов в жировой и др. тканях, тогда как фенотип CD34+ характерен для промежуточных этапов между перицитами, обладающими свойствами стволовых клеток, и широко представленными in vivo адвентициальными клетками. Chen et al. (2013) заключают, что CD34+ и CD34- МСК располагаются соответственно в адвентиции и медии микорсосудов жировой ткани, in vitro эти клетки обладают высокой адипогенной активностью. В культуре этот маркр нестабилен, но в отличие от костномозговых, МСК из жировой ткани на ранних пассажах могут его экспрессировать (Mitchell et al., 2006), поэтому следует с осторожностью подходить к интерпретации результатов. Есть, однако, данные Maumus et al. (2011) о том, что нативные CD34+ МСК из жировой ткани (клоногенные и мультипотентные in vitro) распределены по строме жировой ткани, и только небольшое их количество имеет периваскулярную локализацию. Эти клетки не экспрессируют маркры перицитов (CD140b, NG2, -гладкомышечный актин) in situ, хотя при культивировании эти маркры появляются.

Стромально-васкулярная фракция жировой ткани является богатым источником мультипотентных МСК. Независимо от индивидуальных особенностей пациентов, количество КОЕ-Ф, которые можно получить из стромально-васкулярной фракции липоаспирата, до 400 раз больше, чем из костного мозга (Peroni et al., 2008). По данным Strem et al. (2005) из 1 г жировой ткани можно выделить 5000 МСК, тогда как из 1 мл костного мозга – от 100 до 1000 клеток.

МСК из костного мозга и жировой ткани обладают сходными, хотя вс же не идентичными, эффективностью выделения, иммунофенотипом (Таблица 1.3), морфологией, кинетикой роста и старения, способностью к дифференцировке в различные клеточные линии и эффективностью трансдукции генов (см. обзоры Schffler et al., 2007, Mizuno, 2009).

В работе Westwood, Clements (2007) обнаружено отличие в экспрессии только 25 генов из примерно 10000, экспрессируемых в МСК из костного мозга и жировой ткани.

Wagner et al. (2005) показали, что в МСК из жировой ткани по сравнению c костномозговыми МСК повышена экспрессия Ki-67, cell division cycle associated 8 (CDCA8) и cyclin B2 (CCNB2), что свидетельствует о более высокой пролиферативной активности. Это подтверждает наблюдения Lee et al. (2004), что МСК из жировой ткани вплоть до 20-го пассажа в культуре пролиферируют быстрее, чем костномозговые стромальные предшественники. Кроме того, в них экспрессируются молекулы, типичные для эмбриональных клеток, например Oct4, а также молекулы, которые прежде не обнаруживались в стволовых клетках прочих линий, например, undifferentiation transcription factor (UTF-1) и Nodal (задействованы в миграции эмбриональных

–  –  –

предшественников и важны для поддержания эмбриональных клеток в культуре в недифференцированном состоянии). При культивировании in vitro экспрессия UTF-1 и Nodal постепенно снижается, что может говорить о переходе клеток в более дифференцированное состояние (Peroni et al., 2008; Baglioni et al., 2009).

Время удвоения мезенхимной стромальной клетки из жировой ткани человека составляет приблизительно от 2 до 4 дней и зависит от возраста донора, типа жировой ткани (белая или бурая), типа хирургической процедуры, в ходе которой получен материал, условий культивирования, плотности посадки и компонентов среды (Schffler et al., 2007). Время удвоения МСК зависит также от области, из которой выделена жировая ткань: Van Harmelen et al. (2004) установили, что МСК из подкожной жировой ткани пролиферируют быстрее (время удвоения 4±1 дня), чем из жировой ткани сальника (5±1 дней). Способность прикрепляться и пролиферировать более выражена у МСК, выделенных из жировой ткани молодых доноров, чем у МСК от более старых доноров, но способность к дифференцировке с возрастом не изменяется (см. обзор Mizuno, 2009).

после нескольких пассажей МСК из жировой ткани обладают In vitro мультипотентностью и способны подвергаться адипогенной, остеогенной, хондрогенной, миогенной (рабдомиоциты, лейомиоциты, кардиомиоциты) дифференцировке, а также образовывать нейронподобные, эпителиальные, эндотелиальные клетки и гепатоциты.

МСК из жировой ткани способны выполнять роль гемопоэз-поддерживающей стромы, хотя с несколько меньшей эффективностью, чем МСК из костного мозга (Парфенова и др., 2009; Маслова и др., 2013; Schffler et al., 2007; Andreeva et al., 2013). По данным Kern et al. (2006) МСК из жировой ткани вплоть до 8 пассажа могут не проявлять признаков старения, тогда как костномозговые МСК стареют уже к 7-ому пассажу.

Важно отметить, что операция по выделению жировой ткани сравнительно проста, сама жировая ткань (подкожная) является доступной, а ранее даже рассматривалась просто как «отход» хирургических операций, процедуры ферментативного выделения МСК несложные (Schffler et al., 2007).

Таким образом, МСК из жировой ткани по своим основным характеристикам очень близки к костномозговым МСК, что позволяет рассматривать их как альтернативный источник клеток для экспериментальных и клинических исследований.

1.1.5. Участие МСК в регенеративных процессах МСК способны in vitro и in vivo дифференцироваться в клетки как мезенхимных, так и немезенхимных тканей, в частности, в фибробласты, остеобласты, хондроциты, адипоциты, клетки гемопоэз-поддерживающей стромы, кардиомиоциты, миофибробласты, перициты, скелетные миоциты, тендоциты, клетки сетчатки, нервные клетки, астроциты, гепатоциты и клетки поджелудочной железы (см. обзоры Pountos et al., 2005, 2007; Giordano et al., 2007; Westwood, Clements, 2007). In vitro были получены данные о появлении у МСК признаков дифференцировки ренальных клеток и кардиомиоцитов при контакте их с клетками соответствующих культур (Плотников и др., Помимо этого, была обнаружена способность МСК поддерживать образование 2012).

капилляроподобных структур (Rubina et al., 2009), встраиваться в эндотелиальную выстилку растущих капилляров и периэндотелиальное пространство вновь образующихся сосудов, способствуя их стабилизации (Калинина и др., 2011). Было сделано предположение, что МСК в организме отвечают за нормальный гомеостаз и обновление взрослых тканей, по крайней мере, мезенхимного происхождения (Caplan, 2009).

Считается, что МСК выступают в качестве участников репаративной регенерации тканей. В ответ на повреждение ткани фагоциты продуцируют воспалительные медиаторы, такие как ФНО-альфа, ИЛ-1бета, свободные радикалы, различные хемокины и лейкотриены. Формируется воспалительное окружение, мобилизующее в зону повреждения костномозговые МСК и тканевые резидентные МСК, располагающиеся вокруг сосудов (Ma et al., 2014; Caplan, 2015). МСК локально продуцируют биоактивные молекулы, которые ингибируют миграцию в этот локус компонентов активированной иммунной системы. Это является первой линией защиты организма от аутоиммунных процессов. Кроме того, они продуцируют молекулы, которые формируют зону регенерации. Среди этих молекул значительное количество составляют компоненты внеклеточного матрикса, молекулы, определяющие клеточную адгезию, подвижность, развитие сосудов (Kalinina et al., 2015).

В зоне регенерации происходит:

1 - остановка образования рубцовой ткани;

2 - ингибирование апоптоза, который запускается вследствие ишемии, вызванной нарушением целостности сосудов; таким образом ограничивается область повреждения;

3 - стимуляция образования и стабилизации новых сосудов;

4 - секреция трофических факторов, которые вызывают репликацию тканевых предшественников (см. обзор Caplan, 2015).

Есть данные о том, что при инъекции МСК преимущественно мигрируют в области повреждения, в частности, области гипоксии, апоптоза и воспаления. И по-видимому, основной эффект осуществляется за счт регуляторной деятельности МСК, а не дифференцировки их в клетки поврежднной ткани или слияния с функционирующими клетками (Caplan, 2009; Strioga et al., 2012). Kinnaird et al. (2004) показали, что положительный терапевтический эффект может быть оказан при введении только кондиционированной среды от МСК. Кроме того, есть данные о том, что МСК способны оказывать положительное воздействие даже в случае, когда они накапливаются в сосудах лгких при системном введении, при том, что поврежднная ткань может быть расположена сравнительно далеко от области их накопления (Strioga et al., 2012).

Было показано, что МСК способны образовывать контакты с in vitro кардиомиоцитами, и через них может осуществляться транспорт компонентов цитоплазмы, в том числе митохондрий (Plotnikov et al., 2008). Авторы делают предположение, что такой механизм передачи митохондрий от МСК к кардиомиоцитам реализуется при патологических состояниях сердечной мышцы, когда нарушается функционирование митохондрий и требуется восстановление энергетического баланса в клетке. Аналогичный механизм был обнаружен для МСК и нейронов коры головного мозга. Кроме того, нейропротекторное действие МСК усиливается за счт выработки ими нейротрофического фактора BDNF, которая стимулируется при взаимодействии с нейронами (Плотников и др., 2015).

Таким образом, хотя точный механизм действия МСК в организме не установлен, уже обнаруженные свойства указывают на значимость этих клеток в регенеративных процессах. Поэтому клиницисты возлагают большие надежды на их применение в регенеративной медицине.

1.1.6. МСК в клеточной терапии и регенеративной медицине В настоящее время разрабатываются подходы для использования МСК в терапии различных заболеваний и уже проведн ряд доклинических и клинических испытаний, результаты которых показали эффективность применения этих клеток (Шумаков и др., 2003; Фатхутдинов и др., 2005; Андреева и др., 2009; Бухарова и др., 2009, 2012; Мелихова и др., 2009; Дробышев и др., 2011; Орлов и др., 2011; Баранов и др., 2013; Силачв и др., 2015; Ankrum et al., 2014; Farini et al., 2014; Squillaro et al., 2015). Имеются данные о механизмах терапевтического действия МСК, трансплантированных реципиенту (Таблица Список заболеваний, для лечения которых разрабатывают технологии с 1.4).

применением МСК, включает болезни, связанные с нарушением функций мышц, в т.ч.

миодистрофия Дюшенна (авторы связывают терапевтическое действие МСК с дифференцировкой в сателлитные клетки, экспрессирующие дистрофин, а также с подавлением воспалительных процессов и иммунной реакции), нарушения целостности кости различного генеза, несовершенный остеогенез (МСК приживались, пролиферировали, образовывали остеобласты, происходило улучшение плотности минерализации кости; хотя с клинической точки зрения количество вовлечнных в регенерацию кости МСК было довольно малым).

Кроме того, показана эффективность использования МСК при сердечно-сосудистых заболеваниях, в частности, инфаркте миокарда (МСК оказывали «трофическое» воздействие, но есть данные и о дифференцировке их в кардиомиоциты), болезнях печени, таких как острая печночная недостаточность, цирроз («трофическое» действие МСК, стимулирующее регенерацию поврежднных тканей и предотвращение их повреждения). Также есть примеры успешного применения МСК при различных аутоиммунных заболеваниях (иммуносупрессивное действие МСК), в т.ч. ревматоидный артрит, системная красная волчанка, диабет типа, при нейродегенеративных заболеваниях, таких как I множественный склероз (МСК осуществляют иммуносупрессивное и нейротрофическое действие), амиотрофический латеральный склероз (выработка трансформированными МСК нужного количества глиального нейротрофического фактора), болезнь Паркинсона (МСК стимулировали выработку тирозин-гидроксилазы и дофамина, оказывали нейропротективное действие за счт выработки ростовых факторов и подавления апоптоза; возлагаются надежды на введение трансформированных клеток, способных синтезировать дофамин), болезнь Альцгеймера (активация микроглии, модуляция воспалительного окружения) (Farini et al., 2014).

–  –  –

Хотя изначально на «стволовые» свойства МСК возлагались большие надежды со стороны восстановительной медицины, в настоящее время клиническая ценность МСК рассматривается под другим углом. A. Caplan (2015) отмечает, что терапевтический эффект МСК осуществляется в основном за счт их регуляторных свойств, которые к стволовости никакого отношения не имеют. И чтобы подчеркнуть эти наиболее ценные для клинического применения качества МСК, по его мнению, логичней было бы называть их не «мезенхимные стволовые клетки», а «медицинские сигналинговые клетки».

МСК продуцируют внеклеточные везикулы, в том числе экзосомы, и целый ряд цитокинов и факторов роста, которые оказывают «трофическое» действие (Caplan, 2009), а также подавляют иммунный ответ, ингибируя пролиферацию Т- и В-клеток, созревание моноцитов и способствуют образованию регуляторных Т-клеток и М2 макрофагов (Nauta and Fibbe, 2007; Franois et al., 2012; Bernardo and Fibbe, 2013; Prockop, 2013). Поэтому, хотя по устоявшемуся мнению МСК должны характеризоваться на основании их дифференцировочного потенциала in vivo и способности поддерживать гемопоэз, существует и точка зрения о необходимости проведения более широкого анализа, который будет акцентирован не столько на «стволовых» характеристиках клеток, сколько на их трофических и иммуномодуляторных способностях, которые делают их потенциально пригодными для лечения различных заболеваний (Caplan and Correa, 2011; Keating, 2012;

Fibbe et al., 2013; Phinney et al., 2013; Pittenger, 2013). Так как «трофические» и иммуномодуляторные способности МСК в значительной степени обусловили быстрый рост исследований МНС-несовместимых МСК для терапевтического использования, возможно, следовало бы более обширно изучать именно эти характеристики МСК. Важно также помнить, что в культуре МСК сравнительно легко придать определнный фенотип с тем, чтобы более эффективно применять их для лечения определнных болезней; такие клетки в широком понимании могут считаться МСК и не обязательно должны соответствовать минимальному набору критериев МСК, установленному в 2006 г. (см.

обзор Ankrum et al., 2014).

Для того, чтобы научиться наиболее эффективно применять свойства МСК, нужно учитывать, в каких условиях они будут функционировать. Стоит помнить о том, что МСК в организме взаимодействуют со многими факторами. И важно понять, как на эти клетки влияет микроокружение, в которое они вплетены, будучи участниками различных процессов, проистекающих в тканях организма.

1.2. Содержание кислорода как фактор микроокружения МСК Микроокружение стволовых клеток является важным фактором, регулирующим судьбу этих клеток и влияющим на их самообновление и дифференцировку (см. обзор Watt and Hogan, 2000), таким образом контролируя выполнение их основных функций (физиологическое, репаративное замещение). В 1978 году R. Schofield сформулировал гипотезу «гемопоэтической ниши», которая формирует гемопоэз-поддерживающее микроокружение для присутствующих в ней стволовых клеток. Вслед за этим последовал ряд работ по исследованию ниш стволовых клеток различных тканей (см. обзор Li and Xie, 2005). Ниша стволовой клетки может быть определена, как анатомический компартмент, состоящий из клеточных и неклеточных компонентов, которые обеспечивают различные системные и локальные сигналы и таким образом контролируют пролиферацию стволовых клеток, определяют судьбу дочерних клеток и защищают пул стволовых клеток от истощения и гибели (Yin and Li, 2006; Buravkova et al., 2011).

Клеточные и неклеточные компоненты ниши можно условно разделить на 4 группы:

регуляторные молекулы (О2, питательные вещества, цитокины), клетки, составляющие нишу (3D-структура, межклеточные контакты, аутокринные и паракринные сигналы), внеклеточный матрикс, физические факторы (ток жидкости, сжатие, растяжение, электрические сигналы) (Vunjak-Novakovic, Scadden, 2006).

МСК как компоненты различных тканей соседствуют с разными типами клеток и находятся в окружении разнообразных молекулярных факторов. Но помимо этого, в зависимости от ткани, в которой локализуются, они оказываются в условиях различной оксигенации. Даже несмотря на периваскулярную локализацию МСК, в тканях они находятся при довольно низких значениях концентрации О2. Этот показатель, в зависимости от васкуляризации и структуры соответствующего органа, в организме варьирует в широких пределах: 4-14% О2 в паренхиме лгких, системном кровотоке и в паренхиматозных органах с хорошей микроциркуляцией (печень, почки, сердце), в других тканях с более слабой микроциркуляцией концентрация О2 ниже: 0,5-7% в мозге, 1-5% в глазу (обзор Ivanovic, 2009). In vivo концентрация О2 в костном мозге варьирует от 4% до 6%, но в удалении от кровеносного сосуда может снижаться до 1-2% (Cipolleschi et al., 1993; Lennon et al., 2001; Ma et al., 2009) (Таблица 1.5). Таким образом, МСК и другие клетки стромы способны существовать в гипоксическом (по сравнению с атмосферным содержанием О2) микроокружении (Winkler et al., 2010). Для обозначения условий с пониженным относительно атмосферного («нормоксия») уровнем О2 принято использовать термин «гипоксия». Этот термин справедлив, если применять его для характеристики условий, в которых находится организм в целом. Но если речь идт о клетках и тканях, то физиологически нормальным для них является как раз пониженное по сравнению с атмосферным содержание О2, и в таком случае было бы уместно характеризовать эти условия как «физиоксия» (термин впервые использовался в обзоре В стандартных условиях культивирования (20% О2), которые Carreau et al., 2011).

повсеместно используются в лабораторной практике, клетки подвергаются воздействию значительно большего количества О2, чем in vivo (Holzwarth et al., 2010). Для подбора наилучших условий культивирования МСК важно найти оптимальную концентрацию О 2 (Das et al., 2010). И существует вполне обоснованная точка зрения, что для исследований in vitro и для клинического применения более благоприятно проводить культивирование МСК в гипоксических условиях (от 1 до 10% О2) (Majore et al., 2009; Wagner et al., 2010).

–  –  –

1.2.1. Молекулярный механизм ответа МСК на пониженную концентрацию О2 Гипоксия играет существенную роль в поддержании гомеостаза тканей организма с самого начала эмбрионального развития, обеспечении плюрипотентности стволовых клеток, индукции дифференцировки и регуляции различных сигнальных каскадов (Lin et al.

, 2008). В гипоксических условиях эти функции регулируются различными транскрипционными факторами, такими как факторы, индуцируемые гипоксией (HIF), пролилгидроксилазы, фактор, ингибирующий HIF-1 (FIH-1), активирующий белок 1 (APядерный фактор (NF)-B, р53, c-Myc (Kenneth and Rocha, 2008). Хотя взаимодействие всех этих факторов важно для клеточного ответа, факторы HIF, в особенности HIF-1, являются ключевыми регуляторами клеточного ответа на гипоксию (Stamati et al., 2011).

Механизм действия фактора HIF-1 изучен довольно подробно (Semenza, 2007.) (Рисунок 1.1). В норме синтез фактора HIF-1 происходит постоянно, но в присутствии О2 он быстро метаболизируется: пролилгидроксилазы (неактивны при 1-4% О2 ) гидроксилируют консервативные пролиловые остатки на HIF-1, далее следует связывание с белком фон Хиппель-Линдау, который направляет субъединицу на убиквитин-зависимую протеасомную деградацию. Ещ один уровень контроля – фактор FIH-1, который неактивен в гипоксических условиях, но в присутствии О 2 гидроксилирует аспарагиновый остаток на трансактивационном домене HIF-1. При гипоксии HIF-1 стабилизируется и мигрирует в клеточное ядро, где соединяется с конститутивно экспрессирующимся фактором, индуцируемым гипоксией-1 бета (HIF-1). Далее, этот димер присоединяется к гипоксия-чувствительному домену (hypoxia-response element, HRE), связанному с коактиватором, например, CBP/p300, и таким образом осуществляет регуляцию экспрессии около 70 генов, которые участвуют в метаболизме, ангиогенезе, инвазии и др., определяя судьбу клетки (см. обзоры Hill et al., 2009, Haque et al., 2013).

Рисунок 1.1.

Схема реализации HIF-1-опосредованного ответа на гипоксию (по Rapisarda, Melillo, 2012) 1.2.2. Изменение свойств МСК при гипоксических значениях концентрации О2 1.2.2.1. Морфология и иммунофенотип Holzwarth et al. (2010) после 14 дней культивирования не обнаружили различий в иммунофенотипе МСК при 20% и 1% О2. Исследования коллектива нашей лаборатории также показали стабильную экспрессию маркров МСК при культивировании их в условиях 20% и 5% О2 (Буравкова и др., 2009).

Есть данные о том, что значимых отличий в морфологии МСК при атмосферном и пониженном (2%) содержании О2 нет (Valorani et al., 2012) Но другие исследователи выявляли среди МСК в гипоксии морфологически менее дифференцированные клетки, у которых было меньшее количество митохондрий, более крупное и менее сложное ядро, больше ядрышек и выше ядерно-цитоплазматический индекс (Delorme et al., 2006; Baksh et al., 2007; Zhang et al., 2007), что, возможно, свидетельствует о более активном метаболизме клетки, не зависимом от кислорода, и подготовке к делению.

Экспрессировалось большее количество молекул адгезии и внеклеточного матрикса, таких как коллаген, матриксные металлопротеиназы, сериновые протеазы и ингибиторы сериновых протеаз (Grayson et al, 2007; Ohnishi et al., 2007; Basciano et al., 2011).

1.2.2.2. Жизнеспособность и метаболизм Снижение концентрации О2 в среде практически не отражается на уровне апоптоза МСК (Ефименко и др, 2010). Уровень некроза снижается, причм при 1,5% О2 довольно значительно. Это может указывать на происходящую в условиях пониженного содержания кислорода адаптацию клеток к энергетическим нуждам (Рылова и др., 2010;

Буравкова и др., 2011; Lavrentieva et al., 2010). Под воздействием фактора HIF-1 происходит изменение экспрессии генов, ответственных за метаболизм глюкозы, в частности, глюкозо-6-фосфат транспортра, который участвует в глюконеогенезе. Повидимому, это приводит к повышению уровня глюкозы в клетке, что способствует выживанию в гипоксических условиях (Ren et al., 2006; Hung et al., 2007; Martin-Rendon et al., 2007).

МСК, как и другие клетки, способны менять метаболизм глюкозы с аэробного на анаэробный: при пониженной концентрации кислорода в среде МСК переходят на гликолиз, увеличивается потребление глюкозы и выработка лактата (Буравкова и др., 2011; Grayson et al., 2006; Dos Santos et al., 2010). Такой вариант изменения метаболического пути также является существенным для выживания этих клеток в гипоксических условиях (Das et al., 2010).

Возможно, более высокий уровень жизнеспособности при гипоксии по сравнению с нормоксией связан не только с оверэкспрессией HIF-1, но и HIF-3 (Погодина и др., 2014) а также с повышением уровня рецепторов к эритропоэтину и антиапоптотических факторов Bcl-2 и Bcl-XL и понижением уровня каспазы-3 (Hu et al., 2008; Wang et al., 2008) 1.2.2.3. Пролиферация Влияние уровня О2 на скорость пролиферации клеток (линейный трансформированный эпителий почки кролика) в культуре было продемонстрировано ещ в 1958 году: тогда Cooper et al. и Zwartouw and Westwood наблюдали увеличение пролиферативной активности при пониженном содержании О2 по сравнению с нормальным атмосферным уровнем.

К настоящему моменту показано, что понижение концентрации кислорода до близкой к значениям в тканях (1-10%) увеличивает пролиферативную активность МСК из различных источников (Буравкова и др., 2009; D'Ippolito et al., 2006; Malladi et al., 2006;

Fehrer et al.. 2007; Grayson et al., 2007; Dos Santos et al., 2010; Iida et al., 2010; Nekanti et al., 2010 ; Valorani et al., 2010; Basciano et al., 2011) и их способность к образованию КОЕ-Ф (Fehrer et al., 2007; Dos Santos et al., 2010; Iida et al., 2010). Basciano et al. (2011) предположили, что клетки становятся более чувствительными к ростовым факторам, присутствующим в сыворотке, а также повышают экспрессию рецепторов к цитокинам и факторам роста, активация которых стимулирует пролиферацию.

1.2.2.4. Дифференцировка/пластичность Наличие у МСК мультилинейного потенциала – одна из причин, делающих их привлекательными для регенеративной медицины (Baksh et al., 2004). Согласно ряду исследований, дифференцировка МСК в различных направлениях может как усиливаться, так и замедляться в гипоксических условиях (Holzwarth et al., 2010; Hung et al., 2012;

Huang et al., 2011). При тканевых значениях концентрации О2 дифференцировка МСК в остео- и адипогенном направлении замедляется (Гринаковская и др., 2009; D'Ippolito et al., 2006; Malladi et al., 2006; Fehrer et al., 2007; Iida et al., 2010), а хондрогенная – напротив, усиливается (Wang et al., 2005; Khan et al., 2010). В то же время по данным некоторых авторов при гипоксии МСК более склонны к остеогенной (Baksh et al., 2004; Zhang et al., 2007; Valorani et al., 2010; Hung et al., 2012) и адипогенной дифференцировке (Valorani et al., 2010; Basciano et al., 2011). Есть данные, свидетельствующие о том, что повышение плотности МСК благоприятствует остеогенной дифференцировке (Zhou et al., 2011). На фоне этого активацию остео-дифференцировки МСК при пониженной концентрации О2 можно связать с более высокими темпами пролиферации в этих условиях. Помимо этого, МСК при низком О2 активно формируют капилляроподобные структуры в среде Matrigel, проявляя ангиогенную активность (Annabi et al., 2003).

Можно предположить, что при низких значениях концентрации О 2 происходит поддержание недифференцированного состояния МСК. Об этом свидетельствуют высокий уровень пролиферации, сниженная активность диффернцировки, смещение энергетического обмена в сторону гликолиза, что обусловлено изменением транскрипционной активности соответствующих генов. Было продемонстрировано, что при пониженном содержании О2 повышается экспрессия в МСК основных генов, отвечающих за «стволовость»: Oct-4, Rex-1, SSEA-4 (D'Ippolito et al., 2006), STRO-1 (Iida et al., 2010), Sca-1+ и Sca- 1+/CD44+, Sox2 (Valorani et al., 2010), Nanog (Fehrer et al., 2007;

Valorani et al., 2010). Кроме того, в этих условиях увеличивается транскрипционная активность генов, опосредующих «пластичность» МСК и дифференцировку в эпителиальном, нейрональном, мышечном направлениях (Basciano et al., 2011).

Увеличение экспрессии маркеров «стволовости» указывает на способность МСК при пониженной концентрации О2 проявлять свойства менее коммитированных клетокпредшественников, в таких условиях характеризуясь более слабо выраженной дифференцировочной активностью при остео- и адипоиндукции (Гринаковская и др., 2009; D'Ippolito et al., 2006; Malladi et al., 2006; Fehrer et al., 2007; Iida et al., 2010; Valorani et al., 2010).

1.2.2.5. Миграция в зону повреждения В последние годы появляются экспериментальные подтверждения того, что МСК привлекаются в зоны повреждения тканей, например, при переломах, инфаркте миокарда, ишемических повреждениях мозга, где они участвуют в регуляции воспалительного ответа и восстановления тканей (Maeda et al., 2006; van Velthoven et al., 2010). Таким образом, возможно, осуществляется приток МСК собственного резерва организма в ишемизированные и, следовательно, обедннные кислородом области для участия в регенеративных процессах. Rochefort et al. (2006) в экспериментальной модели in vivo показали, что МСК, а не гемопоэтические клетки-предшественники, мобилизуются в периферическую кровь из костного мозга при гипоксии. В обзоре Ejtehadifar et al. (2015) указывается на наличие некоторых противоречий в данных разных авторов: в исследованиях Naruse et al., Zvaifler et al., Kuznetsov et al., Wu et al. показано, что в гипоксических условиях в периферической крови обнаруживались клетки, сходные с костномозговыми МСК, в то же время Lazarus et al., Wexler et al. таких эффектов не выявили.

Снижение уровня О2 через HIF-1 стимулирует экспрессию на МСК хемокиновых рецепторов CXCR4, CXCR7, CX3CR1, с которыми могут связываться хемокины (например, стромальный фактор SDF-1, фракталкин) секретируемые поврежднными тканями, и таким образом способствует направленной миграция МСК в зону повреждения (Liu et al., 2012; обзор Haque et al., 2013). Кроме того, Rosov et al. (2008) обнаружили, что гипоксия индуцирует повышение экспрессии cMet, рецептора гепатоцитарного фактора роста ГФР, а также усиление cMet-сигналинга.

В ряде исследований показано увеличение миграционной активности МСК in vitro в гипоксических условиях (1-3%) по сравнению с нормоксией (Annabi et al., 2003; Rosov et al., 2008; Hung et al., 2012). Есть данные о том, что в гипоксических условиях увеличивается экспрессия металлопротеиназы MT1-MMP, действие которой значимо для миграции МСК. В то же время снижается секреция MMP-2, а секреция тканевого ингибитора металлопротеиназы TIMP-2 остатся неизменной (Rosov et al., 2008). Кроме того, HIF-зависимо повышается экспрессия и секреция васкулярно-эндотелиального фактора роста VEGF (Okuyama et al., 2006; Rosov et al., 2008), CXCL7, TIMP-1, Lселектина (Naaldijk et al., 2015).

В зависимости от условий оксигенации чувствительность МСК к различным цитокинам может отличаться. Naaldijk et al. (2015) обнаружили, что в нормоксии ФНОальфа, фактор роста фибробластов (ФРФ), тромбоцитарный фактор роста (ТрФР) и SDF-1 стимулируют миграцию МСК. В гипоксии (1%) стимулирующее воздействие оказывали те же ФНО-альфа, ТрФР, ФРФ, а также ИФН-гамма, но не SDF-1. Авторы делают предположение, что в гипоксических условиях чувствительность МСК к ИФН-гамма, одному из важнейших воспалительных медиаторов (Schoenborn, Wilson, 2007), оправдана запуском гипоксия-индуцированного ответа. В то время как SDF-1 – хемоаттрактант, важный для ангиогенеза, и возможно, не играющий столь существенной роли при клеточном ответе на стресс, вызванный гипоксией.

Интересно, что паракринные факторы, выделяемые самими МСК в гипоксических условиях, стимулируют миграцию МСК (т.о. осуществляется аутокринная регуляция) (Rosov et al., 2008). Помимо этого, медиаторы, продуцируемые МСК в гипоксическом окружении, (среди них VEGF, ГФР, ФРФ, ТФР-бета) in vivo способствуют выживанию клеток в области ишемии, привлечению эндотелиоцитов и ангиогенной активности (см.

обзор Андреева, Буравкова, 2013) Таким образом, концентрация О2 существенно влияет на метаболизм МСК, их жизнеспособность, пролиферацию, дифференцировку, паракринную активность и др.

Можно предположить, что от значения этого показателя будет зависеть результат взаимодействия МСК с другими клетками, в т.ч. иммунными.

1.3. Иммуномодуляторные свойства МСК Способность МСК модулировать иммунный ответ - одно из важных свойств этих клеток, ценное с точки зрения терапевтического использования. Иммунная реакция представляет собой сложный каскад взаимодействий различных типов клеток. МСК способны повлиять на результат, воздействуя на различные этапы этого процесса.

1.3.1. Воздействие МСК на клеточные компоненты иммунной системы:

1.3.1.1. Т-лимфоциты В экспериментах in vitro была показана способность МСК ингибировать аллоантиген-специфическую пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток (Di Nicola et al., 2002).

Выделенные Th1 клетки в присутствии МСК секретируют меньше ИФН-гамма, а Th2 больше ИЛ-4 (Aggarwal, Pittenger, 2005). В in vivo моделях наблюдался сдвиг в сторону противовоспалительных Th2 цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13) (Batten et al., 2006; Bai et al., 2009; Choi et al., 2011). Также отмечено, что происходит ингибирование Th17 в пользу образования Th2 (Duffy et al., 2011; Tatara et al., 2011).

Подавление МСК Т-клеточного ответа опосредуется растворимыми молекулами простагландин Е2 (ПГЕ2) и индоламин-2,3-диоксигеназа (ИДО), которые, в частности, ингибируют пролиферацию Т-лимфоцитов (Misel et al., 2004; Najar et al., 2010). Есть также данные о вовлечении в процессы иммунорегуляции непосредственных контактов между этими клетками. В этом задействованы негативная костимуляторная молекула B7H4, Fas-F/Fas взаимодействия, PD-L1/PD-1 путь (Duffy et al., 2011; Sivanathan et al., 2014).

МСК могут подавлять Т-клеточный ответ не только за счт непосредственного воздействия на эффекторные (киллеры и хелперы) клетки, но и способствуя повышению уровня Treg (Pianta et al., 2014), что было продемонстрировано in vitro и in vivo. Функции этих клеток связаны с защитой от различных аутоиммунных процессов и отторжения аллогенного материала (Wang et al., 2009). English et al. (2009) показали, что непосредственный контакт с МСК, а также продуцируемые ими цитокины ПГЕ2 и трансформирующий фактор роста-бета (ТФР-бета) стимулируют дифференцировку Тлимфоцитов в направлении Treg.

Однако в определнном цитокиновом микроокружении (при относительно низком, физиологическом уровне ИФН-гамма), МСК могут проявлять свойства антигенпрезентирующих клеток (АПК) за счт экспрессии MHCII, вызывая активацию Тлимфоцитов и стимулируя иммунный ответ аллоспецифических Т-клеток памяти (Majumdar et al., 2003; Chan et al., 2006).

Таким образом, МСК за счт контактных и паракринных механизмов способны модулировать иммунный ответ, как подавляя, так и индуцируя его через воздействие на эффекторные и регуляторные Т-лимфоциты.

1.3.1.2. Натуральные киллеры (НК) НК занимаются распознаванием «сво-чужое» и способны лизировать клеткимишени, экспрессирующие стимуляторные лиганды. Помимо этого, они продуцируют различные провоспалительные цитокины, в частности, ФНО-альфа, ИЛ-10, ИФН-гамма.

Активация НК происходит при связывании соответствующих лигандов с рецепторами (Ly49, NKG2, KIR) и воздействии провоспалительных цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18) (Vivier et al., 2011).

МСК in vitro подавляют цитокин-опосредованную пролиферацию НК, экспрессию активаторных рецепторов (NKp44, NKp30, NKG2D, CD132) (Spaggiari et al., 2006;

Spaggiari et al., 2008), цитотоксичность (Sotiropoulou et al., 2006) и способствуют снижению продукции ИФН-гамма, ФНО-альфа и ИЛ-10 при активации (Sotiropoulou et al., 2006).

МСК осуществляют ингибирование пролиферации, экспрессии маркров активации и продукции цитокинов НК-клетками за счт растворимых факторов, среди которых ИДО, ПГЕ2, растворимый лейкоцитарный антиген человека-G5 (sHLA-G5) (Selmani et al., 2008; Spaggiari et al., 2008). Для подавления цитотоксической активности нужен непосредственный контакт этих клеток с МСК (Sotiropoulou et al., 2006; Spaggiari et al., 2008).

Наряду с этим есть данные о том, что МСК могут экспрессировать лиганды, которые способны активировать НК, например, NKG2D лиганды. Однако для того, чтобы проявлялось цитотоксическое действие по отношению к МСК, требуется предварительная активация НК цитокинами (Sotiropoulou et al., 2006; Spaggiari et al., 2006).

Можно подытожить, что МСК через паракринное и контактное взаимодействие подавляют цитотоксическое действие НК-клеток и продукцию ими провоспалительных цитокинов. Однако активированные НК могут оказывать и цитотоксический эффект на МСК.

1.3.1.3. Дендритные клетки (ДК) Принцип действия ДК как антиген-презентирующей клетки состоит в том, что при встрече с антигеном (в том числе с аллоантигеном) в присутствии определнных «сигналов опасности» (которые воздействуют на паттерн-распознающие рецепторы или запускают ФНО-альфа/ИЛ-1-путь) начинается их созревание. ДК процессируют антиген и презентируют его фрагменты на молекулах MHCI/II Т-клеткам. Однако если презентация антигена происходит незрелыми ДК, то это приводит к анергии и толерантности Т-клеток.

В ряде исследований in vitro было продемонстрировано, что МСК способствуют формированию толерогенных ДК, ингибируя дифференцировку моноцитов и гемопоэтических предшественников в ДК (Jiang et al., 2005; Nauta et al., 2006; Li et al., 2008). Как следствие нарушения дифференцировки, в ответ на стимуляцию липополисахаридом (ЛПС) ДК экспрессируют меньшее количество HLA-DR и костимуляторных молекул CD80, CD83, CD86, CD40. Таким образом, МСК действуют на раннем этапе дифференцировки ДК. Однако не ясно, оказывают ли МСК какое-либо воздействие на стадии созревания ДК. Существуют данные, свидетельствующие о способности МСК к подавлению созревания генерированных in vitro ДК моноцитарного происхождения (Jiang et al., 2005). Но есть также и результаты, указывающие на противоположный эффект, а также на то, что МСК могут стимулировать ДК смешанной культуры лимфоцитов (Jiang et al., 2005; Spaggiari et al., 2009). Но следует помнить, что in vivo МСК в различных тканях могут столкнуться не только с предшественниками ДК, но и с дифференцированными незрелыми ДК. Кроме того, пул ДК не ограничен только ДК моноцитарного происхождения.

Нет данных о влиянии МСК на способность ДК к миграции. Однако по результатам исследований МСК подавляют экспрессию на ДК CCR7 (English et al., 2008), хемокинового рецептора, который обеспечивает миграцию в лимфатические узлы, а также in vivo при системном введении мыши воздействуют на экспрессию CCR7 и CD49d1, которые также участвуют в миграции в лимфатические узлы (Chiesa et al., 2011).

МСК регулируют продукцию растворимых факторов ДК: образуется меньше провоспалительных ФНО-альфа и ИЛ-12 (Li et al., 2008; Spaggiari et al., 2009; Chiesa et al., 2011; Deng et al., 2014) и больше противовоспалительного ИЛ-10 (Li et al., 2008; Spaggiari et al., 2009; Deng et al., 2014).

По-видимому, ингибиторное действие МСК на ДК осуществляется в основном за счт растворимых молекул, и непосредственный контакт между клетками для этого не обязателен (Bassi et al., 2012). Различные исследования указывали на участие в этом ИЛ-6 и ИЛ-10 (Jiang et al., 2005; Melief et al., 2013), в то же время другие работы не подтвердили этого, но показали важную роль ПГЕ2 (Li et al., 2008; Spaggiari et al., 2009; Yanez et al., 2010; Chiesa et al., 2011). Возможно, что какую-то роль играет контакт-зависимая активация Jagged-2 (Zhang et al., 2009). Кроме того, Chiesa et al. (2011) показали, что молекулярные механизмы воздействия МСК затрагивают молекулярный каскад TLR4, MyD88, Akt, NF-B сигналинг.

Презентация антигена является одним из ключевых этапов запуска иммунного ответа. Путм воздействия на АПК возможно ингибирование следующих звеньев иммунной реакции. Так, было продемонстрировано, что подавление активации Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов в значительной степени опосредовано действием МСК именно на антиген-презентирующие клетки (моноциты), нежели непосредственно на сами Т-лимфоциты (Culter et al., 2010; Franois et al., 2012). А Consentius et al. (2015) обнаружили, что под воздействием МСК дендритные клетки ингибировали цитокиновую секрецию НК.

Обобщая, можно сказать, что МСК посредством паракринных факторов способны ингибировать созревание ДК и секрецию провоспалительных факторов, за счт чего подавляются и следующие этапы иммунного ответа.

1.3.1.4. В-лимфоциты В-лимфоциты выполняют 2 основные функции: благодаря высокой экспрессии MHCI и MHCII вместе с костимуляторными молекулами (CD80, CD40) они могут служить в качестве АПК, в особенности для Т-клеток памяти; другая их важная функция связана с дифференцировкой в клетки, секретирующие антитела.

Исследований, посвящнных изучению влияния МСК на В-клетки, довольно мало, а результаты их разнятся. По некоторым данным МСК увеличивают жизнеспособность, подавляют пролиферацию, дифференцировку и продукцию антител В-клетками (Tabera et al., 2008; Franquesa et al., 2012), но были продемонстрированы и противоположные эффекты на их активацию (Rasmusson et al., 2007; Traggiai et al., 2008; Griffin et al., 2013).

Такие несовпадения в результатах, возможно, обусловлены различиями исходных популяций В-клеток (варьируют чистота и методы выделения), стимуляторов дифференцировки и пролиферации В-клеток, а также разным соотношением МСК и Влимфоцитов (Franquesa 2012). Данные по исследованиям на et al., in vivo экспериментальных моделях аутоиммунных заболеваний и трансплантации свидетельствуют как о возможности МСК ингибировать гуморальный иммунный ответ (Zhou et al., 2008; Ge et al., 2009; Asari et al., 2009; Choi et al., 2012), так и о способности активировать В-лимфоциты (Schena et al., 2010; Youd et al., 2010).

Супрессивное действие, оказываемое МСК на В-лимфоциты, может опосредоваться через модуляцию активности Т-хелперов, а может и осуществляться напрямую: подавление активированных В-лимфоцитов может происходить и в отсутствии Т-клеток. В этих процессах задействованы контакт-зависимые механизмы и паракринные факторы (Franquesa et al., 2012).

1.3.2. Механизм реализации иммуносупрессивных свойств МСК Иммуносупрессия, которую осуществляют МСК, зависит от целого ряда факторов, в т.ч. соотношения МСК и иммунных клеток (дозы МСК, вводимой реципиенту) (Gornostaeva et al., 2015), расстояния между клетками, активации Toll-подобных рецепторов и стимуляции воспалительными цитокинами (обзоры Андреева, Буравкова, 2012; Ankrum et al., 2014). В лаборатории M.J. Hoogduijn (Quaedackers et al. 2009) показали, что за счт выделения хемоаттрактантов CXCL9, CXCL10 и CXCL11 МСК могут способствовать привлечению к ним и накоплению Т-лимфоцитов. При этом активированные CD4+ Т-лимфоциты адгезируют к МСК, и таким образом, возможно, предотвращается развитие иммунной реакции, поскольку эти клетки «изымаются» из системы, инактивируются на МСК. Помимо этого, адгезия к МСК приводит к снижению активности CD8+ Т-лимфоцитов. Причм, по-видимому, в контактных взаимодействиях между МСК и лимфоцитами не участвуют молекулы главного комплекса гистосовместимости и костимуляторные молекулы (в частности, B7-1, B7-2, CD40).

Культивируемые МСК, как правило, экспрессируют малое количество MHCI и не экспрессируют MHCII и костимуляторные молекулы (Le Blanc et al., 2003; Tse et al., 2003), а повышение их экспрессии при стимуляции ИФН-гамма не влияло на адгезию к ним активированных Т-лимфоцитов (Quaedackers et al., 2009). Известно, что адгезию к МСК гемопоэтических предшественников опосредуют молекулы CD9, VCAM, CD44, а также матриксные гликопротеины sc1 и SIM (Miyake et al., 1990, 1991; Oritani et al., 1996;

Aoyama et al., 1999). Возможно, они также участвуют и в прикреплении к МСК иммунных клеток. Вс же клеточный контакт, по-видимому, не является необходимым механизмом иммуномодуляторного действия МСК. В подтверждение тому - результаты исследований, в которых наличие МСК-опосредованной иммуносупрессии не зависело от клеточного контакта, но наиболее выражена она была, когда МСК находились вблизи от клетокмишеней (Горностаева и др., 2013; Di Nicola et al., 2002).

Иммуносупрессивный потенциал МСК определяется целым набором растворимых факторов, многие их которых индуцируются в воспалительном окружении (Ranganath et al., 2012; Prockop et al., 2013) (Таблица 1.6). Ингибирование наиболее важных из них простагландина Е2 и ИДО, приводит только к частичному снижению МСКопосредованной иммуносупрессии (Tse et al., 2003).

–  –  –

(Ryan et al., 2007). Несмотря на то, что большое количество исследований указывает на возможно важную функцию ИДО, вс же МСК, у которых отсутствует рецептор 1-ого типа к ИФН-гамма и ИДО, вс равно осуществляют иммуносупрессивное действие (Gieseke et al., 2007). Это может быть объяснено, по крайней мере отчасти, тем, что Tollподобные рецепторы, экспрессирующиеся на МСК, в отсутствии ИФН-гамма могут повышать иммуносупрессивную активность через аутокринную сигнальную петлю ИФНбета, которая зависит от протеинкиназы R и способна запустить выработку ИДО (Opitz et al., 2009).

Интересно, что у разных видов животных МСК «работают» за счт разных молекул. Если основной иммуносупрессивный эффект МСК человека приписывают ИДО, то у мышей и крыс его связывают с повышенной продукцией NO индуцибельной NOсинтазой (iNOS).

Помимо растворимых факторов и контактных взаимодействий в реализации иммуносупрессивных свойств МСК как in vitro, так и in vivo могут участвовать вырабатываемые ими внеклеточные везикулы (Таблица 1.7). Bruno et al.

(2015) выделили следующие возможные механизмы их действия:

1. Экспрессия на мембране внеклеточных везикул специфических рецепторов, которые могут взаимодействовать с лигандами на клетках-мишенях, таким путм индуцируя функциональные изменения;

2. Интернализация в клетку-реципиент и доставка в не транскрипционных факторов, которые способны повлиять на происходящие в клетки процессы;

3. Доставка в клетку-реципиент функциональных РНК, которые могут работать в качестве инструмента для генетического обмена между клетками.

Таким образом, за счт различных механизмов, включающих контактные взаимодействия и целый спектр секретируемых в среду факторов, в том числе и внеклеточные везикулы, МСК способны осуществлять иммунорегуляцию. Они могут воздействовать на различные звенья иммунного ответа, тем самым приводя к его подавлению активации иммунных клеток (Рисунок 1.2).

–  –  –

Рисунок 1.2.

Возможные механизмы воздействия МСК на иммунные клетки (по Ucelli et al., 2008).

1.3.3. Влияние О2 на иммуномодуляторные свойства МСК В зависимости от локализации клеток, будь то системный кровоток или какая-либо ткань, межклеточное взаимодействие может проходить в условиях различной оксигенации. Очевидно, результат взаимодействий МСК и иммунных клеток будет зависеть не только от состояния МСК. Выше были описаны эффекты снижения содержания О2 на свойства МСК. Этот параметр влияет и на характеристики иммунных клеток, соответственно, его изменение отражается на реализации иммуносупрессивных свойств МСК.

При пониженной концентрации О2 изменяется цитокиновый профиль активированных лимфоцитов, в частности, стимулируется секреция ИЛ-2, ИЛ-4, ИФНгамма (Krieger et al., 1996; Caldwell et al., 2001). Изменяется соотношение CD4/CD8 лимфоцитов в сторону Т-хелперов, но цитотоксическая активность Т-киллеров возрастает (Caldwell et al., 2001). При этом пропорция Th1/Th2 сдвигается в сторону Th2 (Lederer et al., 1999). На незрелых ДК повышается экспрессия CD80, CD86 и HLA-DR, а в зрелых ДК - CD54, CD80, HLA-I, что способствует ингибированию Th1 (Panther et al., 2003).

Меньшее количество лимфоцитов экспрессирует маркр активации но CD25, интенсивность экспрессии выше (Caldwell et al., 2001), в то же время экспрессия CD69 повышается (Krieger et al., 1996). Есть данные о снижении темпов пролиферации активированных лимфоцитов при пониженной концентрации О2, но этот эффект разнится в зависимости от того, каким способом были активированы лимфоциты (Krieger et al., 1996; Conforti et al., 2003). Жизнеспособность активированных лимфоцитов меняется в зависимости от значений концентрации О2: по сравнению тем же показателем при атмосферной концентрации О2 она выше при 5% О2, на том же уровне при 2% О2 и снижается при 1% О2 (Krieger et al., 1996; Naldini et al., 1999).

Работы, посвящнные влиянию концентрации О2 на реализацию иммуномодуляторных свойств МСК, практически отсутствуют. В нашей лаборатории впервые были проведены эксперименты по изучению воздействия МСК на активированные иммунные клетки при пониженной концентрации О 2 (5%). Исходя из полученных результатов можно сделать вывод о том, что при пониженном уровне О2 в присутствии МСК менее выражена активация МНК (CD69, CD25), в большей степени проявляется сдвиг в сторону противовоспалительных медиаторов и снижена выработка провоспалительных цитокинов. Кроме того, сильнее подавляется пролиферация активированных МНК (Андреева и др., 2012; Горностаева и др., 2013).

Таким образом, МСК воздействуют на различных участников иммунных процессов, модулируя функции антиген-презентирующих клеток, в особенности при их дифференцировке из предшественников в ДК. Эти ДК обладают фенотипом толерогенных ДК, характеризуются низкой экспрессией костимуляторных молекул, сниженными показателями миграционной способности по направлению к лимфатическим узлам и секреции противовоспалительных цитокинов. Кроме того, МСК снижают цитотоксическую активность НК-клеток, их пролиферацию и продукцию цитокинов после активации их растворимыми факторами. МСК также способны ингибировать пролиферацию Т-клеток и индуцировать сдвиг с Th1 в направлении Th2 ответа. Данные по влиянию МСК на пролиферацию, дифференцировку и продукцию антител В-клетками противоречивы. Большинство исследований говорят о ведущей роли растворимых факторов в реализации иммуномодуляторных свойств МСК. Однако есть и свидетельства участия в этом контакт-зависимых механизмов.

1.4. Влияние иммунных клеток на МСК Взаимодействующие МСК и иммунные клетки составляют динамическую систему, в которой каждый из компонентов влияет на свойства другого. В предыдущем разделе описано, как за счт контактных взаимодействий и разнообразных секретируемых продуктов (цитокинов и микровезикул) МСК регулируют свойства иммунных клеток. Но, в свою очередь, имеют место и обратные эффекты: иммунные клетки способны оказывать регуляторное воздействие на МСК. Иммунные клетки выделяют целый спектр растворимых факторов. В случае воспалительной реакции и стимуляции иммунного ответа повышается продукция провоспалительных медиаторов, которые воздействуют на функциональные свойства МСК, востребованные в репаративных процессах.

1.4.1. Иммуномодуляция Из-за способности к иммуносупрессии МСК рассматриваются как перспективный инструмент терапии аутоиммунных заболеваний и реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Свойство подавлять иммунный ответ инициируется в определнных условиях.

Секретируемый иммунными клетками ИФН-гамма, который может действовать самостоятельно либо в сочетании с ФНО-альфа, ИЛ-1альфа и ИЛ-1бета, потенцирует («праймирует») иммуносупрессивные свойства МСК, способствует секреции большого количества факторов, участвующих в подавлении иммунной реакции (Krampera et al., 2006; Ren et al., 2008). В подтверждение значимости этого регуляторного механизма результаты исследования in vivo на модели РТПХ: реципиенты IFN--/- Т-клеток не реагировали на введение МСК и погибали из-за РТПХ (Polchert et al., 2008). МСК мышей с недостатком рецептора 1-ого типа к ИФН-гамма не обладают иммуносупрессивной активностью (Ren et al., 2008). Интересно, что индукция иммуномодуляторной активности в МСК происходит только при относительно высоком уровне ИФН-гамма, который наблюдается во время воспалительного ответа. В то же время малые концентрации этого цитокина не вызывают подобной реакции. Наоборот, такие условия способствуют формированию из МСК антиген-презентирующей клетки, экспрессирующей MHCII и костимуляторные молекулы (CD40, CD80 и CD86), и таким образом, стимуляции иммунного ответа (Majumdar et al., 2003; Chan et al., 2006; Oh et al., 2008). Но вс же значительная часть исследований не подтверждает активацию Т-клеток даже предактивированными МСК (Oh et al., 2008; Chinnadurai et al., 2014).

У МСК изначально может быть в разной степени выражена иммуносупрессивная активность, что, по-видимому, зависит от донора. Но под воздействием провоспалительных факторов (ИФН-гамма и ФНО-альфа) вне зависимости от донора МСК одинаково успешно подавляют активацию лимфоцитов (Szab et al., 2015).

Выделяемые иммунными клетками провоспалительные факторы способствуют изменению экспрессии МСК широкого спектра медиаторов, регулирующих иммунный ответ. Falrinner et al. (2012) наблюдали повышение экспрессии мРНК ИЛ-8, но не происходило изменения экспрессии SDF-1 и COX-2. По другим данным в присутствии активированных лимфоцитов повышалась экспрессия COX-2, а также ГФР, HLA-G и ИДО, но отсутствовали изменения ИЛ-10, ТФР-бета, iNOS, гем оксигеназы (Crop et al., 2010). ИЛ-1бета и SCF стимулируют МСК к изменению (как повышению, так и понижению) экспрессии ряда митогенов (NAP2, IGFBP3, ФРФ), иммунорегуляторных молекул (ИЛ-8, ИЛ-2R, MIF, LIGHT) (Czekanska et al., 2015). Посредством таких молекул, как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИФН-гамма, ФНО-альфа может регулироваться секреция МСК различных факторов роста и противовоспалительных факторов (Hemeda et al., 2012; Murphy et al., 2013).

Под воздействием провоспалительных факторов, продуцируемых участниками иммунного ответа, в частности, ИЛ-1бета и SCF, изменяется экспрессии в МСК ряда хемокинов (GCP2, RANTES, MIP1, MIP3, ИЛ-2R, ENA78, ИЛ-8) (Czekanska et al., 2015). ИФН-гамма совместно с ФНО-альфа, ИЛ-1альфа и ИЛ-1бета стимулируют МСК к выбросу цитокинов, в т.ч. лигандов CXCR3 и CCR5, и экспрессию молекул адгезии, таких как ICAM-1, VCAM-1 (Ren et al., 2008, 2010). Совместное действие этих факторов способствует накоплению иммунных клеток в непосредственной близости от МСК. Таким образом формируется микроокружение, в котором усиливается действие локальных факторов, продуцируемых МСК, и это может способствовать иммуносупрессии (см. обзор Ma et al., 2014).

Наличие непосредственного контакта с иммунными клетками может влиять на иммуносупрессивную активность МСК. Hegyi et al. (2012) обнаружили, что МСК при контакте с активированными лимфоцитами продуцировали довольно большое количество ПГЕ2, а при разделении взаимодействующих клеток полупроницаемой мембраной продукция этого цитокина была значительно ниже.

Таким образом, МСК «праймируются» факторами, выделяемыми иммунными клетками в воспалительном окружении. При этом они проявляют паракринную активность и экспрессируют молекулы адгезии, которые обеспечивают их иммуносупрессивные свойства. Происходит подавление иммунной реакции, что, повидимому, может защищать и сами МСК.

1.4.2. Жизнеспособность Свойство, благодаря которому МСК вызывают столь высокий интерес среди исследователей и клиницистов, стремящихся разработать подходы для их терапевтического применения, - низкая иммуногенность этих клеток. Иначе, способность не провоцировать реакцию со стороны иммунных клеток, даже в случае аллогенного взаимодействия. Для МСК характерна низкая экспрессия MHCI (Le Blanc et al., 2003;

Ankrum et al., 2014). Такой иммунофенотип, вероятно, позволяет избегать узнавания и лизиса Т-клетками, но не обеспечивает полной защиты от НК-клеток. Более того, МСК экспрессируют ULBPs, PVR и Nectin-2 - лиганды активационных рецепторов НК-клеток.

Однако распознавание и уничтожение происходит только в случае, если НК-клетки предварительно активированы (Spaggiari et al., 2006). Следует сказать, что in vivo вс же происходит их узнавание иммунной системой, хотя и гораздо медленнее, нежели в случае более коммитированных клеток, в частности, фибробластов. Показано, что в этом участвуют CD8+ Т-клетки и НК-клетки (Zangi et al., 2009). А при повторном введении аллогенных МСК их элиминирование происходит быстрее, что может свидетельствовать о формировании иммунологической памяти (Zangi et al., 2009; Schu et al., 2012).

В то же время есть данные о том, что у «праймированных» ИФН-гамма и ИЛ-1бета МСК in vitro и in vivo повышается экспрессия MHCI (Crop et al., 2011; Schu et al., 2012).

При этом они становятся более подвержены лизису со стороны цитотоксических CD8+ Тлимфоцитов, но не НК-клеток (Crop et al., 2011). Schu et al. (2012) обнаружили снижение жизнеспособности «праймированных» МСК (по сравнению с непраймированными) в культуре при взаимодействии с активированными лимфоцитами, но in vivo такой разницы не наблюдалось.

Таким образом, правильнее говорить, скорее, не об иммунопривилегированности, а об «иммуноуклончивости» МСК, т.е. их способности минимизировать, хотя и не в полной мере, действие иммунных клеток. Выживание МСК, по-видимому, зависит от контекста и обеспечивается за счт баланса между иммуногенными и иммуносупрессивными факторами (Ankrum et al., 2013). Так неспособность активировать иммуносупрессивные программы приводит к тому, что МСК функционируют в большей степени как антигенпредставляющие клетки и могут способствовать развитию воспаления in vivo (Chan et al., 2006; Franois et al., 2009). Но в исследованиях in vitro, где концентрация МСК достаточно высока для того, чтобы значительно повлиять на микроокружение в культуральном флаконе, преобладают иммуносупрессивные свойства МСК. В контексте той или иной ткани важно, насколько выражена иммунореактивность лимфоцитов по отношению к МСК. Было отмечено, что несоответствующие алло- и ксеногенные МСК могут предпочтительно находиться in vivo в том микроокружении, где подавлен иммунный ответ, например, в опухолях, в отличие от каких-либо других тканей того же самого организма (Kidd et al., 2009).;

По-видимому, существует паракринный механизм воздействия иммунных клеток на жизнеспособность МСК, поскольку была обнаружена способность ФНО-альфа, а также факторов, продуцированных активированными макрофагами линии THP-1, активировать механизмы апоптоза у значительного количества МСК (Ефименко и др., 2010).

1.4.3. Морфология и иммунофенотип Crop et al. (2010) наблюдали увеличение размера МСК под воздействием цитокинов, выделяемых смешанной культурой лимфоцитов (СКЛ), а сами клетки сбивались в звездообразные кластеры. В том случае, когда на МСК действовали только провоспалительные цитокины ИФН-гамма, ФНО-альфа и ИЛ-6, никаких очевидных морфологических изменений не зафиксировано.

Такие цитокины воспалительной реакции, как ИФН-гамма, ФНО-альфа и ИЛ-6, как и смесь растворимых факторов, выделяемых активированными лимфоцитами при взаимодействии с МСК, не влияют на экспрессию характерных маркров МСК (English et al., 2007; Crop et al., 2010).

1.4.4. Пролиферация Valencic et al. (2014) показали, что активированные лимфоциты снижают пролиферативную активность МСК. Причм приписать это свойство какой-то определнной популяции клеток не удатся, поскольку подавление пролиферации происходило как в присутствии смеси лимфоцитов, так и после удаления НК-клеток, а также с выделенными популяциями CD4+ и CD8+ лимфоцитов. В то же время неактивированные лимфоциты не оказывали влияние на этот показатель. Авторы считают, что в этой системе в подавлении пролиферации играют роль внеклеточный АТФ и в меньшей степени ФНО-альфа. Интересно, что когда МСК были предварительно обработаны провоспалительным ИФН-гамма, они оказывались в какой-то степени защищены от действия активированных лимфоцитов. Но в случае, когда на МСК действовала кондиционированная среда от активированных лимфоцитов, такое праймирование интерфероном не «спасало» от подавления пролиферации. Возможно, праймированные МСК регулируют активированные лимфоциты таким образом, что сформировавшееся микроокружение уже не столь значительно изменяет свойства МСК;

кондиционированная среда взята от лимфоцитов, которые были активированы, но в этом случае не происходило динамического взаимодействия между клетками, при котором МСК способны регулировать функции лимфоцитов, а не просто односторонне реагировать на выделенные ими цитокины.

В другой модельной системе, где в качестве источника стимуляции использовалась СКЛ, авторы отмечали повышение пролиферативной активности МСК (Crop et al., 2010).

Но когда воспалительное микроокружение создавалось добавлением в среду смеси цитокинов ИФН-гамма, ФНО-альфа и ИЛ-6, наоборот, пролиферация МСК замедлялась.

Freytes et al. (2013) обнаруживали ингибирование роста МСК М1 макрофагами за счт продукции ИЛ-1бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и ИФН-гамма и стимуляцию роста М2 макрофагами и ассоциированными с ними цитокинами ИЛ-10, ТФР-бета1, ТФР-бета3 и VEGF.

Более детальное исследование влияния на пролиферацию МСК различных цитокинов выявило разнонаправленное действие этих факторов. Ряд цитокинов вызывал замедление пролиферации, среди них: ИФН-гамма, ИЛ-1бета, HMGB1, ГФР (Abarbanell et al., 2009; Croitoru-Lamoury et al., 2011; Liu et al., 2013). Некоторые цитокины, напротив, оказывали стимулирующее воздействие: ФНО-альфа, ТФР-бета1 (Abarbanell et al., 2009;

Rodrigues et al., 2010; Zubkova et al., 2016), хотя ранее были получены данные о торможении пролиферации ТФР-бета1 (Romieu-Mourez et al., 2007).

По-видимому, причиной вариабельности результатов могут быть различающиеся подходы в построении модельной системы, использование разных активаторов иммунной реакции и разных способов создания воспалительного микроокружения. В таких системах условия микроокружения, в котором оказываются МСК, будут отличаться друг от друга, где-то в большей степени, где-то менее значительно. Но так или иначе, эти различия могут заметно повлиять на проявление свойств МСК (Gornostaeva et al., 2015).

1.4.5. Миграция Целый ряд исследований указывает на то, что воспалительное микроокружение способствует повышению миграционной активности МСК: стимулирующий эффект проявляют смесь растворимых факторов, секретируемых активированными лимфоцитами (Li et al., 2015), моноцитами (Григорьева и др., 2014), а также цитокины: ИФН-гамма, ФНО-альфа, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, HMGB1, ТФР-бета1, VEGF, IGF-1, ТрФР, ГФР, SDF-1, MCP-1, MCP-3, MIP-1, MIP-3 (Abarbanell et al., 2009, Li et al., 2012, Plotnikov et al., 2013;

Lejmi et al., 2015, Li et al., 2015, Niu et al., 2015, Zubkova et al., 2015). Schmidt-Lucke et al.

(2015) наблюдали миграцию в сердце аутологичных МСК пациентов с воспалительной кардиомиопатией, чему, вероятно, способствовали выделяемые в очаге воспаления цитокины. Таким образом, возможно, стимулируется направленное движение МСК в очаг воспалительной/иммунной реакции, где они будут осуществлять местное регуляторное воздействие.

1.4.6. Дифференцировка Данные о влиянии участников иммунного ответа на дифференцировку МСК неоднозначны. Li et al. (2015) показали, что медиаторы, выделяемые активированными лимфоцитами, стимулируют остеогенную дифференцировку МСК. Схожие результаты получили и Falrinner et al. (2012): кондиционированная среда от смешанной культуры лимфоцитов способствовала остеогенной дифференцировке (но при этом подавляла адипогенную), аналогично действовали и цитокины ФНО-альфа и ИФН-гамма. Эти авторы также отмечали увеличение пролиферативной активности МСК, и возможно, стимуляция остеогенной дифференцировки была связана с возросшей плотностью – эффект, который ранее наблюдали Lohmann et al. (2012). В то же время Crop et al. (2010) не выявили влияния паракринного взаимодействия со смешанной культурой лимфоцитов на дифференцировочный потенциал МСК. Prasanna et al. (2010) также не обнаружили изменения остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцровки МСК под воздействием ИФН-гамма и ФНО-альфа. Более того, имеются данные, что ИФН-гамма способен снижать остеогенный и адипогенный потенциал МСК (Croitoru-Lamoury et al., 2011), а ФНО-альфа – остеогенный, адипогенный, хондрогенный и миогенный (Abarbanell et al., 2009; Suzawa et al., 2011; Lu et al., 2011). Cao et al. (2015) обнаружили снижение экспрессии генов Runx2 (Runt-related transcription factor 2) и Osx (Osterix) – ключевых для остеогенеза транскрипционных факторов. vivo показано, что секретируемые In лимфоцитами реципиента ИФН-гамма и ФНО-альфа подавляют регенерацию кости, осуществляемую за счт аллогенных МСК (Liu et al., 2011). При этом подавление остеогенеза ИФН-гамма может осуществляться через повышение уровня SMAD6 с последующим ингибированием – ключевого фактора остеогенной RUNX2 дифференцировки. ИФН-гамма и ФНО-альфа способны стимулировать апоптоз МСК через интернализацию при этом происходит снижение экспрессии FAS, транскрипционного фактора NF-B и блокаторов клеточной гибели XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) и FLIP (FLICE-inhibitory protein). Liu et al. (2011) показали, что местное введение аспирина и системное введение Treg способны значительно улучшить МСК-опосредованное заживление костей свода черепа за счт снижения уровня ИФН-гамма и ФНО-альфа.

Таким образом, при аллогенном иммунном ответе МСК оказываются под воздействием целого спектра цитокинов, выделяемых иммунными клетками, а также непосредственных контактов с этими клетками. Все вместе эти факторы регулируют свойства МСК, но результат такого взаимодействия в значительной степени зависит от исходного состояния самих МСК. В ответ на факторы, выделяемые иммунными клетками при взаимодействии, может происходить изменение пролиферативной, дифференцировочной активности МСК, способности к поддержанию гемопоэза, экспрессии молекул адгезии, паракринной активности. Однако вопрос о влиянии на МСК иммунных клеток остатся довольно слабо проработанным, как следует из Таблицы 1.8, а значительная часть исследований, посвящнных этой тематике, рассматривает влияние на МСК каких-либо конкретных цитокинов (либо смеси цитокинов). В то же время, в межклеточном взаимодействии участвует целый спектр растворимых факторов и молекул межклеточных контактов, кумулятивное действие которых может отличаться от эффектов каждого из них, взятых по отдельности.

При изучении свойств МСК с помощью создания модели in vitro важно понимать, как концентрация О2, установленная для культивирования, будет влиять на свойства клеток. Это может оказаться существенным для интерпретации результатов и понимания физиологических процессов, происходящих на уровне клеток и тканей. Для различных физиологических ниш характерен разный уровень О2, более высокий в альвеолярных капиллярах и артериальном кровотоке, более низкий в тканях различных органов и венозной крови, очень низкий в ишемизированных областях – при патологических процессах. И поэтому свойства МСК в зависимости от их локализации (способа введения, если речь идт об использовании в терапевтических целях) могут сильно изменяться.

Важно учитывать это, поскольку модификация свойств МСК может отразиться и на взаимодействии их с другими клетками, и как следствие, успехе их терапевтического применения.

–  –  –

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Химические реагенты В работе были использованы следующие реагенты и культуральные среды: Lглутамин (ПанЭко, Россия), раствор трипсина и ЭДТА с концентрациями веществ 0,5 г/л и 0,2 г/л соответственно (Sigma, США), раствор антибиотиков, содержащий 5000 ед/мл пенициллина и 5000 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко), диметилсульфоксид (ДМСО) (ПанЭко), набор для определения жизнеспособности клеток ANNEXIN V-FITC Kit (PN IM3546, Beckman Coulter, США), фосфатно-солевой буфер (ФБ) (ПанЭко), среды культивирования MEM (Gibco, США), эмбриональная телячья RPMI-1640 (Gibco), сыворотка (ЭТС) (HyClone, США), коллагеназа IA (Sigma, США), Ficoll Histopaque 1077 (Sigma), Adipogenesis kit (Millipore, США), индометацин (Sigma); Osteogenesis kit (Millipore); параформальдегид (Merck, Германия), Flow-Check Fluorospheres (Beckman Coulter, США), фитогемагглютинин (ФГА) (Sigma), ализариновый красный (Millipore), масляный красный O (Millipore), цетилпиридиния хлорид (ПанЭко), флуоресцентные зонды MitoTracker Red FM (Molecular probes, США), LysoTracker Green DND26 (Molecular Probes), ER-Tracker Green (BODIPY® TR Glibenclamide) (Molecular Probes), H2DCFDA (Molecular Probes).

2.2. Антитела Для выявления различных антигенов использовали метод прямого иммуноцитохимического окрашивания. Окрашивание проводили при помощи антител (Immunotech, Франция, рабочее разведение 1:50), конъюгированных с флуоресцентными красителями изотиоцианат флуоресцеин (FITC) и R-фикоэритрин (R-PE) (Таблица 2.1).

–  –  –

2.3. Материалы и оборудование Клетки выращивали на чашках Петри (Corning, США) различного диаметра или 6луночных планшетах с полупроницаемыми мембранами-вставками (размер пор 0,4 мм) (Corning, США). Для изучения миграции применяли 24-луночные планшеты с полупроницаемыми мембранами-вставками (размер пор 8 мм) (Corning). При работе с клетками использовали серологические пипетки, центрифужные пробирки различного объема (Corning), криопробирки (Corning), пробирки для проточного цитофлуориметра Германия), микропробирки (Eppendorf, Германия), наконечники для (Sarstedt, автоматических пипеток (Eppendorf).

В работе использовали следующее оборудование: ламинарный шкаф (ВЛ22, Сампо, Россия), СО2-инкубатор (Sanyo, Япония), мультигазовый инкубатор (Sanyo), световой фазово-контрастный флуоресцентный инвертированный микроскоп Nikon Eclipse Ti-U (Nikon, Япония), оснащнный CCD камерой Nikon Digital Sight DS-Ri1 (Nikon) и системой анализа изображения NisElements 32 (Nikon), конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM 780 (Zeiss, Германия), оснащенный инкубационной камерой (5% СО2, 37°С), ксеноновой лампой Х-Сite 120, диодным (405 нм, 30 мВт) и аргоновым (488, 561 и 633 нм, 13 мВт) лазерами, наборами фильтров 488/561/633, 488 – 556 нм, 568 – 685 нм и объективом Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC M27, вортекс (Elmi, Латвия), центрифуга водяная баня (BioSan), проточный Eppendorf 5810 R, цитофлуориметр Coulter Epics XL (Beckman Coulter), проточный цитофлуориметр Accuri C6 (Becton Dickinson, США), планшетный спектрофотометр (Bio-Rad, США), шприцевые фильтры (Millipore), автоматические пипетки (Eppendorf), гемоцитометр (Bright Line, США), холодильник (Indesit, Россия), низкотемпературный холодильник (Sanyo).

2.4. Среды для культивирования клеток Среда для роста МСК Выделение и экспансию МСК проводили в среде -MEM (22561-021, Gibco), содержащей 10% ЭТС (sv30160.03, HyClone) и антибиотик пенициллин-стрептомицин 50 ед/мл (ПанЭко).

Остеогенная среда Среда, стимулирующая остео-дифференцировку МСК, готовилась на основе среды для роста МСК с добавлением 10-8 М дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата и 0,2 мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты (Millipore, США).

Адипогенная среда Среда, стимулирующая адипо-дифференцировку, готовилась на основе среды для роста МСК с добавлением 0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 мкМ дексаметазона, 10 мкг/мл инсулина (Millipore, США), 200 мкМ индометацина (Sigma, США).

Среда для криоконсервации МСК Для криоконсервации МСК использовали ЭТС с 8% ДМСО (Панэко).

Среда для экспериментов по сокультивированию МСК и МНК Все эксперименты проводили в среде RPMI-1640 (31870-025, Gibco), содержащей 5% инактивированной ЭТС, 50 ед/мл антибиотика пенициллин-стрептомицин, 2 мМ Lглутамина, 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) (L8754-5MG, Sigma, США).

2.5. Выделение МСК МСК были получены из жировой ткани 12 практически здоровых доноров, образцы ткани предоставлены клиникой «Союз» в соответствии с договором о научном сотрудничестве с ГНЦ РФ – ИМБП РАН. МСК выделяли с использованием стандартной методики (Zuk et. al., 2001) с модификациями (Buravkova et. al., 2009). Для этого измельчнную жировую ткань (не более 15 мл) помещали в 50 мл пробирку, добавляли ФБ так, чтобы общий объм составлял 40 мл, встряхивали и затем центрифугировали полученную смесь 7 мин при 600g. После удаляли ФБ и осадок эритроцитов, к жировой ткани добавляли равный объм 0,075% раствора коллагеназы IА в среде для роста МСК.

Ферментативная обработка ткани проводилась в течение 20-30 мин на водяной бане (37оС), каждые 5 минут пробирку с тканью встряхивали. Затем фермент инактивировали средой для экспансии МСК таким образом, чтобы общий объм смеси составлял 50 мл.

Центрифугировали 10 мин при 600g. Осадок аккуратно отбирали пипеткой, разводили средой для роста МСК и сажали в чашки Петри из расчта 1х103 кл/см2. Через 24 часа неприкрепившиеся клетки удаляли, чашки Петри с адгезировавшими МСК 3 раза аккуратно промывали ФБ, заливали среду для роста МСК.

2.6. Культивирование МСК Первичную культуру МСК и клетки на последующих пассажах культивировали в СО2-инкубаторе при атмосферном (20%) и в мультигазовом инкубаторе при пониженном (5%) содержании О2. Клетки содержали в среде для роста МСК, смену среды проводили каждые 72 часа.

2.7. Пассирование МСК МСК пассировали после достижения 70-80% монослоя. Чтобы открепить клетки от пластика, их промывали ФБ 3 раза, после чего добавляли 0,05% трипсин-ЭДТА (1х) (Gibco) и равномерно распределяли его по поверхности чашки Петри. Клетки инкубировали с раствором трипсина при 37оС несколько минут, контролируя их открепление под микроскопом. Фермент ингибировали добавлением четырхкратного объма среды для роста МСК. Открепившиеся клетки тщательно ресуспендировали, переносили в центрифужные пробирки, центрифугировали 5 мин при 400g. Осадок клеток после центрифугирования ресуспендировали в среде для экспансии МСК и рассаживали в чашки Петри в концентрации 2 тыс.кл/см2.

2.8. Криоконсервация МСК Для криоконсервации использовали клетки первичной культуры. МСК открепляли при помощи раствора трипсина, как описано в п. «Пассирование МСК». После центрифугирования к 500-750 тыс. клеток добавляли 1 мл среды для криоконсервирования, аккуратно ресуспендировали и переносили в криопробирку.

Пробирки с суспензией МСК выдерживали при -20 оС, на хранение помещали в низкотемпературный холодильник, -80 оС.

2.9. Размораживание МСК Пробирку с замороженными МСК в течение нескольких минут нагревали на водяной бане при 37оС, после чего аккуратно переносили суспензию в центрифужную пробирку с 30 мл среды для роста МСК. Центрифугировали 5 мин при 400g, осадок ресуспендировали в среде для роста МСК и сажали в чашки Петри в концентрации 3 тыс.кл./см2.

2.10. Выделение МНК МНК выделяли из периферической крови добровольцев на градиенте плотности (=1,077 г/л) (Histopaque 1077), согласно стандартному протоколу. Для выделения использовали среду RPMI-1640 с 5% инактивированной ЭТС. Непосредственно перед добавлением к МСК МНК активировали ФГА в концентрации 10 мкг/мл.

2.11. Сокультивирование МСК и МНК Для экспериментов использовали МСК 2-6 пассажей, предкультивированные при 20% и 5% О2, достигшие 70-80% монослоя. Эксперименты по сокультивированию МСК с

МНК проводили при 20% и 5% О2 в 2 системах:

1. «контакт» - МСК и МНК непосредственно контактировали друг с другом. Для этого МСК отмывали от среды для роста, добавляли среду для сокультивирования, содержащую 0,5 млн. МНК/мл, соотношение количества МСК и МНК – 1:10;

2. «трансвелл» - МСК и МНК были разделены полупроницаемой мембраной, которая допускала только паракринные взаимодействия. МСК отмывали от среды роста, добавляли среду для сокультивирования, в камеру с МСК устанавливали трансвелл (Transwell, Corning, 3412, размер пор 0,4 мкм), в него вносили суспензию МНК в среде для сокультивирования. Соотношение количества МСК и МНК было то же, что в системе «контакт».

–  –  –

Рисунок 2.1.

Схема эксперимента по сокультивированию МСК и ФГА-активированных МНК

2.12. Методы исследования 2.12.1. Характеристика апоптотического и некротического путей гибели МСК Детекция апоптических клеток основана на способности белка аннексина V, конъюгированного с флуоресцентным красителем (в нашем случае с флуоресцеин изотиоцианатом (FITC), ex/em 492 нм/520 нм), связываться с фосфатидилсерином. В норме этот фосфолипид присутствует на поверхности клетки в минимальном количестве, но при запуске апоптоза значительное его количество переходит со внутренней стороны плазматической мембраны на наружную.

Определение некротических клеток осуществлялась за счт способности йодида пропидия, обладающего интенсивной флюоресценцией в красной области спектра (ex/em 370, 535 нм/560-680 нм) проникать через поврежднную при некрозе мембрану и встраиваться в малую бороздку ДНК.

МСК открепляли с помощью трипсина, суспензию клеток окрашивали при помощи набора Annexin V – FITC kit (PN IM3546, Beckman Coulter): клетки разводили в 100 мкл свежеприготовленного аннексин-связывающего буфера, в пробу добавляли 5 мкл йодида пропидия (250 мкг/мл), 1 мкл аннексина V (25 мкг/мл), тщательно перемешивали, инкубировали 10 мин при 4оС, после чего добавляли ещ 400 мкл аннексин-связывающего буфера. Готовые пробы анализировали на проточном цитофлуориметре (Epics XL, Beckman Coulter). Живыми считали клетки, не окрашенные аннексином V и йодидом пропидия.

2.12.2. Пролиферативная активность Непосредственно перед началом экспериментов по сокультивированию проводили фотосъмку случайным образом выбранных полей зрения в культуральных чашках с МСК при помощи микроскопа Nikon Eclipse TiU. Эти участки были промаркированы, и сразу после завершения сокультивирования была выполнена их повторная фотосъмка. На полученных изображениях при помощи программы SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США) подсчитывали количество МСК.

После этого определяли кратность увеличения количества клеток, которое использовали для характеристики пролиферативной активности.

2.12.3. Дифференцировка в остеогенном направлении После сокультивирования МСК отмывали ФБ, добавляли к ним остеогенную среду.

Проводили культивирование ещ в течение 20 дней, остеогенную среду заменяли каждые 3 дня.

Выраженность дифференцировки МСК оценивали по минерализации внеклеточного матрикса, который способен связывать пропорциональное количество красителя ализаринового красного. Перед окрашиванием клетки промывали ФБ, фиксировали 4% раствором параформальдегида 15 мин, промывали дистиллятом.

Матрикс окрашивали 40 мМ раствором ализаринового красного 2 мин, остатки красителя отмывали дистиллятом. Связавшийся с матриксом краситель растворяли в 100 мМ цитилпиридиний хлориде при 37оС в течение 30 мин. После этого спектрометрически (Biorad, =560 нм) определяли оптическую плотность получившегося раствора.

2.12.4. Дифференцировка в адипогенном направлении После сокультивирования МСК отмывали от среды, добавляли к ним адипогенную среду. Проводили культивирование ещ в течение недели, адипогенную среду заменяли каждые 3 дня.

Выраженность дифференцировки МСК определяли по накоплению в клетках липидных капель, которые чтко визуализируются при окрашивании масляным красным.

Краситель готовили за 10 мин до использования, непосредственно перед использованием пропускали через фильтр с порами 0,45 мкм. Перед окрашиванием клетки промывали ФБ, фиксировали 4% раствором параформальдегида 15 мин, промывали дистиллятом. Затем быстро ополаскивали промывочным раствором (70% изопропанол, Wash Solution, 90360, Millipore) и добавляли краситель на 10-15 мин. После окрашивания остатки красителя отмывали дистиллятом. При помощи светового микроскопа получали изображения случайных полей зрения готовых препаратов, для подсчта количества дифференцированных клеток использовали программу SigmaScan.

Анализ дифференциовки МСК проводили полуколичественным методом.

Визуально оценивали накопление липидных включений, руководствуясь следующими критериями: 0 балов – липидные включения практически отсутствуют, 1 балл – в МСК присутствуют мелкие включения, 2 балла – липидные включения заполняют значительную часть объма МСК, 3 балла – в цитоплазме МСК помимо мелких липидных включений, заполняющих практически весь объм МСК, присутствуют крупные липидные капли (Рисунок 2.2.).

отсутствие дифференцировки, 0 баллов 1 балл 2 балла 3 балла

Рисунок 2.2. Характеристика адиподифференцировки МСК

2.12.5. Оценка функционального состояния митохондрий, лизосом, эндоплазматического ретикулума, продукции активных форм кислорода Анализ внутриклеточных органелл МСК после взаимодействия с МНК проводили при помощи флуоресцентных зондов:

- митохондрии – MitoTracker Red FM (ex/em ~581/644 нм) – потенциал-зависимый зонд, пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и накапливается внутри активных митохондрий;

- лизосомы - LysoTracker DND26 (ex/em ~504/511 нм) – ацидофильный зонд, высоко селективен к органеллам с кислым pH; состоит из флуорофора, связанного со слабым основанием, частично протонированным при нейтральном pH, свободно проникает через клеточные мембраны и накапливается в органеллах с низким рН. Механизм его накопления в органеллах до конца не установлен, но предполагается, что в этом участвует протонирование и удержание в мембранах органелл.

- эндоплазматический ретикулум (ЭПР) - ER-Tracker Green (BODIPY® FL Glibenclamide) (ex/em ~504/511 нм) – конъюгирован с глибенкламид BODIPY® FL. Глибенкламид связывается с рецепторами сульфонилмочевины АТФ-чувствительных К-каналов, характерных для мембраны ЭПР;

- активные формы кислорода (АФК) - H2DCFDA (ex/em ~492-495/517-527 нм) – нефлуоресцирующая восстановленная и ацетилированная форма 2',7'дихлорфлуоресцеина, при попадании в клетку подвергается окислению и деацетилированию внутриклеточными эстеразами, в результате чего образуется флуоресцирующий продукт. Эстеразы отщепляют липофильную блокирующую группу, при этом получается заряженная молекула красителя, которая гораздо лучше удерживается в клетке, чем соединение, из которого она образовалась.

Рабочие концентрации зондов:

MitoTracker Red FM - 0,5 мкМ LysoTracker DND26 – 0,05 мкМ ER-Tracker Green – 1 мкМ H2DCFDA – 1 мкМ После проведения эксперимента МСК отмывали от среды, добавляли к ним среду для сокультивирования, содержащую один из зондов. МСК инкубировали с зондами 30 мин при 37оС в условиях 20% и 5% О2. После этого клетки отмывали ФБ, открепляли при помощи трипсина и анализировали на проточном цитофлуориметре.

2.12.6. Конфокальная микроскопия Конфокально-микроскопические исследования проводили совместно с д.м.н.

С.В. Буравковым (ФФМ МГУ им. М.В. Ломоносова). Выполняли прижизненную фотосъмку клеток, покрашенных при помощи флуоресцентных зондов MitoTracker Red FM, LysoTracker DND26, ER-Tracker Green и H2DCFDA. Для наблюдения и фотосъмки использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM 780 (Zeiss, Германия), оснащенный инкубационной камерой (5% СО2, 37°С).

2.12.7. Иммуноцитохимический анализ Стромальный фенотип МСК характеризовали по наличию/отсутствию следующих антигенов: CD73, CD105, CD90 (маркры МСК) и CD45 (маркр лейкоцитов). Помимо этого, проводили анализ изменения экспрессии молекулы адгезии ICAM1 (CD54). Для выявления упомянутых антигенов применяли антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем: anti-CD73-FITC, anti-CD105-phycoerythrin (PE), anti-CD90FITC, anti-CD45-PE, anti-CD54-PE, в качестве контроля использовали соответствующие IgG-FITC и IgG-PE (Beckman Coulter IO Test, США).

МСК после сокультивирования промывали ФБ, открепляли при помощи трипсина.

На одну пробу брали 100 мкл суспензии МСК в ФБ, содержащей 100 тыс.кл. В пробу добавляли 10 мкл антител, окрашивание проводили 20 мин. После этого добавляли 400 мкл ФБ и проводили цитофлуориметрический анализ.

2.12.8. Определение содержания цитокинов в среде культивирования После 72 ч сокультивирования МСК и МНК собирали кондиционированную среду, центрифугировали 5 мин при 400g, отбирали супернатант и замораживали при -800С (низкотемпературный холодильник Sanyo). Перед выполнением анализа образцы среды согревали до комнатной температуры и вновь центрифугировали. Для того, чтобы оценить содержание в среде растворимых медиаторов, использовали 2 метода:

1. анализ при помощи наборов FlowCytomix human Th1/Th2 11 Plex (BMS810FF) и Human VEGF-A FlowCytomix Simplex (BMS80277FF, eBioscience, Bender MedSystems, Австрия).

Эти наборы позволяют выявить содержание в среде следующих цитокинов: ИЛ-1бета, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12p70, ИФН-гамма, ФНО-альфа, ФНО-бета, VEGF. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре (FaxCalibur, Becton Dickinson).

В данном наборе используется принцип твердофазного иммуноферментного анализа, где в качестве твердой фазы выступают полистироловые гранулы (d=5,5 мкм), конъюгированные с соответствующими анти-цитокиновыми антителами.

Для определения содержания цитокинов в пробах использовали калибровочные растворы, содержащие известные концентрации цитокинов. Исследуемые образцы и контрольные растворы смешивали с буфером, содержащим полистировые гранулы. После специфического связывания гранул с цитокинами, содержащимися в пробах, в реакционную смесь добавляли биотинилированные анти-цитокиновые антитела и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Далее пробы центрифугировали (5 мин при 500g) удаляли супернатант, добавляли стрептавидин, меченный фикоэритрином (PE), и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Затем образцы снова центрифугировали, ресуспендировали в буфере и анализировали на цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Diсkinson, США). Концентрация каждого цитокина являлась функцией интенсивности флуоресценции и вычислялась с помощью программы FlowCytomix Pro. Чувствительность метода представлена в Таблице 2.2.

–  –  –

2. иммуноферментный анализ при помощи LIF Human ELISA Kit (ab100582, Abcam).

Метод основан на трхстадийном «сэндвич»-варианте твердофазного иммуноферментного анализа с использованием моно- и поликлональных антител к лейкемия-ингибирующему фактору (ЛИФ).

Для определения содержания аналита в пробах использовали калибровочные растворы, содержащие известные концентрации цитокинов. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы в течение 2,5 часов инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах ЛИФ связывался с иммобилизованными антителами. Затем при инкубации в течение 1 часа связанный ЛИФ взаимодействовал с антителами к ЛИФ человека, конъюгированными с биотином. На третьей стадии биотин взаимодействовал со стрептавидином, связанным с пероксидазой хрена, инкубация 45 мин. После каждой из описанных выше стадий выполняли четырхкратную промывку промывочным буфером. Количество связавшегося стрептавидина определялось цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина, реакцию проводили 30 мин в темноте, по окончании инкубации добавляли стоп-раствор. Измеряли оптическую плотность раствора в лунках при 450 нм. Интенсивность жлтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце ЛИФ. После измерения оптической плотности на основании калибровочного графика рассчитывалась концентрация ЛИФ в анализируемых образцах.

2.12.9. Анализ дифференциальной экспрессии генов МСК, сокультивировавшиеся с МНК в отсутствие прямого контакта («трансвелл») открепляли с помощью трипсина и осуществляли криоконсервацию в RNAlater (Qiagen, США) при -300С. РНК выделяли из МСК, предварительно отмыв их от стабилизирующего реагента, с помощью TRIzol (Invitrogen), согласно инструкции производителя. В полученных образцах определяли содержание РНК с использованием Nanodrop, после чего 200 нг РНК было амплифицировано с помощью набора Illumina® TotalPrep™ RNA Amplification Kit (Ambion, США). Амплифицированная РНК подвергалась гибридизации на микрочипах Human-Ref-12 (Illumina, США), согласно протоколу производителя.

Анализ полученных данных производился с помощью программного обеспечения GenomeStudio v2009.2 (Gene Expression Module v1.5.4, Illumina) с использованием статистического модуля для анализа экспрессии генов. При 20% и 5% О2 оценивали изменение экспрессии генов МСК после сокультивирования с МНК по сравнению с монокультурой МСК. Различия считались статистически значимыми при p0,05.

Для того, чтобы проанализировать, с какими функциональными изменениями в клетке могут быть связаны возрастание/снижение экспрессии тех или иных генов, все гены, у которых изменялась транскрипционная активность, были объединены в группы генной онтологии (Gene Ontology) согласно их биологической функции (Biological function). Анализ проводили при помощи программы EASE v2.0 (Hosack et al., 2003).

2.12.10. Проточная цитофлуориметрия Иммунный профиль, состояние органелл и жизнеспособность МСК определяли на проточных цитофлуориметрах Beckman Coulter EPICS XL и Becton Dickinson Accuri C6.

Метод проточной цитофлуориметрии основан на пропускании суспензии клеток по капилляру по одной через луч лазера, который используется для возбуждения флуоресценции. При помощи светочувствительных датчиков (фотодиодов и фотоэлектронных умножителей) регистрируются поглощение и рассеивание света (прямое светорассеяние под углом 0,5-2о и угловое светорассеяние под углом 90о) клеткой, которые характеризуют размер, форму, плотность клетки и гранулярность внутриклеточных структур, а также флуоресценция связанных с клеткой красителей.

При иммунофенотипировании использовали детекцию флуоресценции красителей флуоресцеинизотиоционат (FITC) и фикоэритрин (PE), связанных с моноклональными антителами против определенных поверхностных антигенов – кластеров дифференцировки (CD). При ДНК-цитометрии в качестве флуорохрома, связывающегося с ДНК, использовали йодид пропидия. Для изучения органелл применяли флуоресцентные зонды, способные накапливаться в соответствующих компартментах клетки.

2.12.11. Направленная миграция МСК Оценивали активность миграции МСК по направлению к МНК в модифицированной камере Бойдена, где в качестве нижней камеры выступали ячейки 24луночной платы, а верхней камеры – ячейка-вставка (трансвелл, Corning), дно которой представляет собой полупроницаемую мембрану с диаметром пор 8 мкм. В лунки планшета добавляли 600 мкл суспензии МНК в той же концентрации, что в эксперименте по сокультивированию. В качестве контроля выступала среда для сокультивирования.

Эксперимент выполнялся в 3 повторах. В ячейки 24-луночной платы помещали трансвеллы и добавляли в них 150 мкл суспензии МСК (7 тыс.) в среде для экспериментов по сокультивированию. Планшеты на 24 часа оставляли в СО2-инкубаторе (20% О2) и мультигазовом инкубаторе (5% О2). Затем трансвеллы ополаскивали ФБ и на 15 мин помещали в лунки с 4% параформальдегидом, чтобы зафиксировать прикрепившиеся МСК. После фиксации трансвеллы ополаскивали дистиллятом и при помощи ватной палочки удаляли с внутренней стороны трансвелла те МСК, которые адгезировали к его поверхности, но не мигрировали в направлении нижней камеры. Затем трансвеллы помещали на 10 мин в лунки с 0,1% раствором Тритона в дистилляте для пермеабилизации мембраны. Далее следовала промывка дистиллятом и инкубация в течение нескольких минут с 300 мкл/мл раствором йодида пропидия в ФБ. После финальной промывки дистиллятом трансвелл устанавливался на предметное стекло и изучался на флуоресцентном микроскопе. Производилась фотосъмка не менее 10 полей зрения. На полученных фотографиях подсчитывалось количество клеток (окрашенных йодидом пропидия ядер) в программе для анализа изображений SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США). Исходя из размера поля зрения (0,55 мкм2), рассчитывали количество мигрировавших МСК на единицу площади (1 мм2).

2.12.12. Ненаправленная миграция МСК Влияние МНК на подвижность МСК оценивали в модели «раны». На монослое МСК при помощи 200 мкл наконечника для автоматической пипетки стерильно наносили повреждение. Среду с фрагментами разрушенных клеток удаляли, добавляли среду для экспериментов по сокультивированию. На дне чашки Петри с МСК случайным образом маркировали не менее 5 участков раны и проводили их фотосъмку на микроскопе Nikon Eclipse Ti-U (точка 0 часов). Далее в течение суток культивировали МСК при 20% и 5% О 2 в 3 группах: 1. К – монокультура МСК; 2. «контакт» - к МСК добавляли суспензию МНК в той же концентрации, что для экспериментов по сокультивированию; 3. «трансвелл» МСК отделяли от суспензии МНК полупроницаемой мембраной. Через 24 часа проводили фотосъмку маркированных полей зрения. В программе для анализа изображений Nis Elements 32 измеряли площадь раны. По уменьшению площади раны за сутки оценивали подвижность МСК.

2.13. Статистическая обработка В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее и стандартное отклонение. Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы Statistica 7.0 для WinXP с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимости p=0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Характеристика МСК и МНК в монокультуре при различном уровне О2 Перед тем, как приступить к изучению особенностей взаимодействия МСК и МНК в зависимости от содержания О2 в микроокружении, представлялось целесообразным охарактеризовать состояние обоих типов клеток в монокультурах, которые предполагалось использовать как клетки сравнения.

МСК в монокультуре к моменту завершения экспериментов достигали монослоя с конфлуентностью 80-90% как при 20%, так и при 5% О2. Вне зависимости от содержания О2 в популяциях преобладали клетки с фибробластоподобным фенотипом. Большая часть МСК имела веретенообразную форму, среди них присутствовали более крупные хорошо распластанные клетки (Рисунок 3.1).

20% О2 5% О2 Рисунок 3.1. Монокультура МСК при различном содержании О2. 72 ч культивирования, 6й пассаж. Фазовый контраст. Масштабный отрезок 100 мкм Цитофлуориметрический анализ после окрашивания аннексином V и йодидом пропидия выявил относительно низкий процент клеточной гибели. Доля живых (Ann-/PI-) МСК составляла 92,1±2,7% при 20% О2 и 95,2±0,5% при 5% О2.

Иммунофенотипирование не выявило отличия по экспрессии основных маркров стромального фенотипа: CD73, CD90, CD105. Практически 100% МСК при обеих концентрациях О2 были положительно окрашены (Рисунок 3.2, Таблица 3.1).

–  –  –

Для подтверждения мультипотентности в МСК индуцировали дифференцировку в остео- и адипогенном направлениях согласно стандартным протоколам. Как при 20%, так и при 5% О2 МСК отвечали на остеоиндукцию. Через 21 день можно было гистохимически выявить вновь образованный минерализованный матрикс с помощью окрашивания ализариновым красным. При пониженной концентрации О 2 остеогенная активность МСК была менее выражена (Рисунок 3.3).

20% О2 5% О2 Рисунок 3.3. Остеодифференцировка МСК при 20% и 5% О2. Минерализованный матрикс окрашен ализариновым красным. Микроскопия в светлом поле. Масштабный отрезок 200 мкм.

В присутствии индукторов адиподифференцировки через 7 дней наблюдалось накопление в цитоплазме МСК жировых включений (Рисунок 3.4). Выраженность дифференцировки не зависела от концентрации О2.

20% О2 5% О2 Рисунок 3.4. Адиподифференцировка МСК при 20% и 5% О2. Окрашивание липидных включений масляным красным О. Световая микроскопия. Масштабный отрезок 100 мкм.

Для характеристики клеточных органелл и содержания АФК были использованы флуоресцентные зонды. Изучение митохондрий проводили при помощи потенциалзависимого зонда MitoTracker Red FM, который накапливается в активных митохондриях.

После окрашивания в цитоплазме выявлялась разветвлнная сеть митохондрий, распределнных по всей клетке. Зонд LysoTracker DND26 накапливался в везикулах с кислым содержимым (низким рН), которые располагались по всему объму цитоплазмы.

МСК в монокультуре, по-видимому, были гетерогенны по лизосомальной активности:

клетки варьировали по интенсивности накопления этого зонда. ЭПР детектировали при помощи зонда ER-Tracker Green, который специфически связывается с рецепторами на поверхности этих органелл. Этот зонд детектировался по всему объму цитоплазмы, наиболее выраженно – в области вокруг ядра. В ряде случаев наблюдалось накопление ER-Tracker в мелких везикулярных структурах. Уровень АФК в МСК оценивали при помощи зонда H2DCFDA, чувствительного к этим соединениям. Зонд H2DCFDA давал диффузное окрашивание цитоплазмы, единичные клетки отличались более интенсивным накоплением этого зонда по сравнению с остальными МСК в монокультуре (Рисунок

3.5.А). Количественный анализ проводили по данным цитофлуориметрического исследования: по величине средней интенсивности флуоресценции (СИФ) делали вывод о накоплении соответствующего зонда. Было обнаружено, что СИФ МСК, обработанных каким-либо из зондов: MitoTracker Red FM, LysoTracker DND26, ER-Tracker Green, H2DCFDA – не зависела от концентрации О2. Таким образом, не было выявлено значимых

–  –  –

ЭПР (ER-Tracker Green) АФК (H2DCFDA)

3.2. Характеристика монокультуры МНК Ранее в нашей лаборатории было показано, что МНК в течение 72 ч после активации ФГА сохраняют высокую жизнеспособность: при 20% и 5% О 2 она составляла 81±2% (Горностаева и др., 2011).

По результатам цитофлуориметрического анализа соотношение основных субпопуляций МНК, полученных от разных доноров для настоящего исследования, находилось в пределах референсных физиологических показателей (клинической нормы) (Таблица 3.2).

–  –  –

Анализ активации лимфоцитов в настоящем исследовании подтвердил ранее полученные в нашей лаборатории результаты. Было показано, что стимуляция ФГА при 5% О2 ведт к повышению доли Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркры активации CD25, CD69, HLA-DR (Рисунок 3.6). Доля активированных клеток при этом соответствует значениям, описанным после активации при 20% О2 (Андреева и др., 2013).

–  –  –

Рисунок 3.6.

Экспрессия маркров активации на нативных и ФГА-стимулированных Тклетках в монокультуре. 72 ч, 20% и 5% О2 Для характеристики паракринной активности ФГА-стимулированных МНК в кондиционированной среде при помощи мультиплексного цитофлуориметрического анализа были определены цитокины, участвующие в развитии воспалительной реакции (Рисунок 3.7). Значимого различия в количестве продуцируемых цитокинов при 20% и 5% О2 не было отмечено.

–  –  –

3.3. МСК после взаимодействия с неактивированными МНК При морфологическом анализе не было отмечено каких-либо различий между МСК в монокультуре и при контактном и паракринном взаимодействии с МНК при обеих концентрациях О2, клетки сохраняли характерный фибробластоподобный фенотип.

Практически все МНК находились в суспензии, только единичные клетки прикреплялись к МСК (Рисунок 3.8). При обеих концентрациях О2 контактное и паракринное взаимодействие с неактивированными МНК не отразилось на жизнеспособности МСК, доля Ann-/PI- МСК составляла 96,8±0,3%.

20% О2 5% О2 МСК «контакт»

«трансвелл»

Рисунок 3.8.

МСК в монокультуре (МСК) и после 72 ч сокультивирования с неактивированными МНК при наличии контакта («контакт») и разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). Фазовый контраст. Масштабный отрезок 100 мкм Присутствие неактивированных МНК практически не отразилось на состоянии органелл МСК. Не выявлено изменений трансмембранного потенциала митохондрий после окрашивания MitoTracker. Также практически не изменялся размер ЭПР.

Наблюдалось небольшое повышение СИФ после окрашивания H2DCFDA, что может говорить о некотором увеличении количества АФК, и снижение СИФ зонда LysoTracker, свидетельствующее об уменьшении активности лизосомального компартмента (Рисунок 3.9).

Митохондрии (MitoTracker Red FM) ЭПР (ER-Tracker Green)

–  –  –

Рисунок 3.9.

Характеристика клеточных органелл и уровня АФК после 72 ч взаимодействия МСК с неактивированными МНК в условиях наличия непосредственного контакта («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл») при 20% и 5% О2. Данные репрезентативного эксперимента представлены как кратность отличий значений средней интенсивности флуоресценции (СИФ) в МСК после сокультивирования с МНК к СИФ монокультуры МСК.

Таким образом, неактивированные иммунные клетки не оказывают цитотоксического воздействия на МСК и практически не влияют на состояние клеточных органелл.

–  –  –

Для оценки эффектов аллогенных активированных МНК периферической крови, после взаимодействия с ними были проанализированы свойства МСК, характеризующие их внутреннее состояние, а также связанные с межклеточным взаимодействием и реализацией их регенеративного потенциала.

3.4.1. Жизнеспособность

Цитофлуориметрический анализ МСК после окрашивания аннексином V и йодидом пропидия позволял оценить долю живых и погибших клеток, а также выявить пути гибели. При обеих концентрациях О2 не было обнаружено значимого влияния контактного и паракринного взаимодействия с ФГА-МНК на долю живых (Ann-/PI-) МСК (Рисунок 3.10). Тем не менее, необходимо отметить тенденцию к уменьшению процента живых клеток при прямом контакте («контакт») при обеих концентрациях О 2 за счт апоптотического (Ann+) и некротического (PI+) путей гибели (Таблица 3.3).

Рисунок 3.10.

Характеристика жизнеспособности МСК после 72 ч взаимодействия с ФГАМНК при непосредственном контакте («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). Жизнеспособность МСК в монокультуре принята за 100%.

Данные представлены как M±m, n=8 Таблица 3.3. Доля апоптотических и некротических клеток в общей популяции МСК после 72 ч культивирования, %

–  –  –

После паракринного взаимодействия с ФГА-МНК при 20% О2 по сравнению с монокультурой МСК наблюдалось более активное накопление в клетках зонда MitoTracker и, как следствие, увеличение СИФ, что может говорить о повышении количества активных митохондрий или росте трансмембранного потенциала этих органелл (Рисунок 3.11).

Рисунок 3.11.

Изменение митохондриальной активности МСК после 72 ч взаимодействия с ФГА-МНК при непосредственном контакте («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). СИФ митохондрий МСК в монокультуре принята за 1.

Данные представлены как M±m, n=8 # - достоверное отличие от МСК в монокультуре при 20% О2 (p0,01)

3.4.2.2. Лизосомы

При непосредственном контакте с ФГА-МНК при 5% О2 детектировалось повышение интенсивности флуоресценции зонда LysoTracker по сравнению с МСК в монокультуре, что в этом случае может свидетельствовать об увеличении объма лизосомального компартмента МСК или его закисления. В других условиях оксигенации и наличии только паракринных взаимодействий в отсутствие прямого контакта также прослеживалась тенденция к увеличению лизосомальной активности, однако эти изменения не были достоверными (Рисунок 3.12).

Рисунок 3.12.

Изменение лизосомальной активности МСК после 72 ч взаимодействия с ФГА-МНК при непосредственном контакте («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). СИФ лизосом МСК в монокультуре принята за 1.

Данные представлены как M±m, n=8 * - достоверное отличие от МСК в монокультуре при 5% О2 (p0,01)

3.4.2.3. Эндоплазматический ретикулум

Было отмечено, что при паракринном взаимодействии, а также при непосредственном контакте с ФГА-МНК в условиях пониженной концентрации О2 флуоресценция ER-Tracker снижалась на треть по сравнению с МСК в монокультуре. Это может говорить об уменьшении объма ЭПР в МСК. В то же время, непосредственный контакт с ФГА-МНК при 20% О2 не приводил к достоверному изменению этого показателя (Рисунок 3.13).

Рисунок 3.13.

Изменение размера ЭПР в МСК после 72 ч взаимодействия с ФГА-МНК при непосредственном контакте («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). СИФ ЭПР МСК в монокультуре принята за 1.

Данные представлены как M±m, n=3 #, * - достоверное отличие от МСК в монокультуре при 20% и 5% О2 соответственно (p0,01)

3.4.2.4. Продукция АФК

После контактного взаимодействия с МНК при обеих концентрациях О2 наблюдалась тенденция к увеличению флуоресценции зонда H2DCFDA в МСК по сравнению с монокультурой, что отражает накопление АФК в клетках (Рисунок 3.14).

Хотя эти изменения не были достоверными, в ряде экспериментов контакт с МНК вызывал повышение уровня АФК в МСК.

Рисунок 3.14.

Изменение продукции АФК в МСК после 72 ч взаимодействия с ФГА-МНК при непосредственном контакте («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). СИФ АФК МСК в монокультуре принята за 1.

Данные представлены как M±m, n=8

–  –  –

Контактное и паракринное взаимодействие с МНК при обеих концентрациях О2 не повлияло на экспрессию стромальных маркров МСК: на подавляющем большинстве клеток на них детектировались молекулы CD73, CD90, CD105 и отсутствовали CD45 (Таблица 3.4).

–  –  –

Надо отметить, что хотя процент МСК, экспрессирующих CD90, под воздействием МНК не изменился, при 5% О2 вс же наблюдалось некоторое снижение экспрессии этого маркра, о чм свидетельствует уменьшение СИФ клеток, окрашенных при помощи соответствующих антител (Рисунок 3.15).

Рисунок 3.15.

Изменение экспрессии CD90 на МСК после 72 ч взаимодействия с ФГАМНК при непосредственном контакте («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). Экспрессия CD90 МСК в монокультуре принята за 1.

* - достоверное отличие от МСК в монокультуре при 5% О2 (p0,01) Данные представлены как M±m, n=6

3.4.4. Пролиферативная активность

Один из важных функциональных параметров МСК, определяющих регенеративный потенциал этих клеток – их способность к пролиферации. В стандартных условиях культивирования при плотности посадки 7,5х103 кл/см2 за 5-7 дней МСК практически достигали монослоя. В гипоксических условиях пролиферация МСК происходила активнее, и при плотности посадки 7х103 кл/см2 они достигали 70-80% монослоя за то же время (2-4 дня), что МСК, посаженные в большей плотности (7,5х103 кл/см2) при 20% О2. При сокультивировании с МНК было обнаружено, что контактное взаимодействие с иммунными клетками подавляет пролиферативную активность МСК при обеих концентрациях О2. В то же время паракринные взаимодействия с МНК не оказывали значимого влияния на пролиферацию МСК (Рисунок 3.16).

Рисунок 3.16.

Изменение пролиферативной активности МСК после 72 ч взаимодействия с ФГА-МНК при непосредственном контакте («контакт») и при разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл»). Пролиферативная активность МСК в монокультуре принята за 1 Данные представлены как M±m, n=4 #, * - достоверное отличие от МСК в монокультуре при 20% и 5% О2 соответственно (p0,01) Несмотря на то, что паракринное взаимодействие не привело к значимому изменению пролиферативной активности МСК, при полногеномном анализне дифференциальной экспрессии генов наблюдалось изменение транскрипции большого числа генов, продукты которых на различных этапах осуществляют регуляцию клеточного цикла (ANLN, BIN1, BTG3, CCNA2, CCNB2, CCT7, CDC20, CDKN2B, CDKN3, CKS2, F2R, IFITM1, IL1B, IL8, LTBP2, MAD2L1, MCM5, MN1, RECK, SPHK1, STAT1, UBE2C) (GO:0051726), митоза (ANLN, CCNA2, CCNB2, CDC20, KIF11, MAD2L1, PRC1, PTTG1, UBE2C) (GO:0007067), репликации ДНК и хромосомного цикла (MAD2L1, MCM4, MCM5, MCM7, PTTG1, RRM1, SSBP1, TOP2A) (GO:0000067). При 20% О2 эти изменения затронули большее количество генов, чем при 5% О2 (Рисунок 3.17).

Рисунок 3.17.

Изменение экспрессии генов МСК, связанных с пролиферацией (cell proliferation - GO:0008283), после паракринного взаимодействия с ФГА-МНК

–  –  –

Миграционная активность – один из параметров, определяющих регенеративный потенциал МСК. При этом важно, насколько эти клетки могут быть подвижными, а также сколь интенсивно они будут перемещаться по направлению к стимулам, выделяемым иммунными клетками в воспалительном окружении.

3.4.5.1. Ненаправленная миграция

Изучение миграции на модели «раны» предполагает оценку того, насколько быстро МСК заполняют область, не занятую клетками. Таким образом, оценивается подвижность МСК.

С использованием данной модели было обнаружено снижение подвижности МСК при 20% О2 под воздействием контактных и паракринных взаимодействий с МНК:

площадь «раны» через 24 ч после е нанесения была больше, чем в случае монокультуры МСК (Рисунок 3.18, 3.19). Также можно было отметить тенденцию к снижению подвижности МСК при наличии контакта с МНК в условиях 5% О2, хотя эти различия не были достоверными. В данной модели также не было обнаружено зависимости данного параметра от концентрации О2 (Рисунок 3.18).

Рисунок 3.18.

Ненаправленная миграция МСК в монокультуре (МСК) и при прямом («контакт») и паракринном («трансвелл») взаимодействии с ФГА-МНК. Миграцию оценивали, как изменение площади раны через 24 часа после е нанесения. Данные представлены, как M±m (n=4).

#, * - достоверное изменение по сравнению с МСК в монокультуре при 20% и 5% О2 соответственно (p0,05)

–  –  –

Рисунок 3.19.

Ненаправленная миграция МСК в модели «раны». МСК в монокультуре и сокультивируемые с ФГА-МНК при наличии прямого контакта («контакт») и разделении полупроницаемой мембраной («трансвелл») в условиях 20% и 5% О 2, 24 ч.

Репрезентативные фотографии фиксированных полей зрения. Фазовый контраст.

Масштабный отрезок 100 мкм 3.4.5.2. Направленная миграция Для того, чтобы оценить активность миграции МСК по направлению к факторам, выделяемым активированными иммунными клетками, использовали модифицированную камеру Бойдена. Камера Бойдена применяется для изучения хемотаксической активности лейкоцитов и хемоаттрактантной активности биологических жидкостей и состоит из двух цилиндров диаметром 5-10 мм, разделенных полупроницаемой мембраной, через которую происходит миграция клеток из верхнего отсека в нижний. В данном случае, в верхнюю камеру помещались МСК, в нижнюю – МНК (в качестве контроля использовали среду).

Подсчт количества МСК, мигрировавших за 24 ч через полупроницаемую мембрану по направлению к МНК в нижней камере, показал, что в присутствии МНК миграционная активность МСК снижалась при 20% и 5% О2: на нижней стороне мембраны насчитывалось меньшее количество МСК, чем в том случае, когда в нижней камере была

–  –  –

5% О2 Рисунок 3.20. Направленная миграция МСК в модифицированной камере Бойдена. К – миграция МСК в направлении культуральной среды; МНК – миграция МСК в направлении суспензии МНК, 20% и 5% О2 в среде. А. Репрезентативные фотографии.

Ядра МСК окрашены йодидом пропидия. Флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок 100 мкм; Б. Количество мигрировавших МСК. Данные представлены как M±m (n=3).

# - достоверное отличие от контроля при 20% О2 (p0,01) * - достоверное отличие от контроля при 5% О2 (p0,01) & - достоверное отличие от 20% (p0,01) Паракринные факторы, выделяемые активированными МНК, способствовали некоторому повышению экспрессии генов, связанных с клеточной миграцией (GO:0016477). При обеих концентрациях О2 четырхкратно возросла экспрессия гена SLIT2, положительного регулятора глипикана. При 20% О2 в 2,5 раза увеличилась транскрипционная активность гена киназы сфингозина SPHK1, а при 5% - почти в 7 раз – экспрессия гена гиалуронансинтазы HAS1.

Таким образом, под воздействием ФГА-МНК происходило ингибирование миграции, как ненаправленной, так и направленной. Несмотря на то, что наблюдалось повышение транскрипционной активности генов, способствующих миграции, подвижность МСК и хемотактическая активность были снижены.

–  –  –

Способность к дифференцировке в остеогенном направлении является базовым свойством МСК и одновременно с этим - функциональным параметром, важным для их терапевтического применения. Для того, чтобы оценить влияние иммунных клеток на этот параметр МСК, после 72 ч взаимодействия с ФГА-активированными МНК к МСК добавляли остеоиндуктивную среду. Как параметр, характеризующий дифференцировку МСК, оценивали накопление минерализованного матрикса за 21 день культивирования в индукционной среде. Было обнаружено, что контактное взаимодействие с МНК приводило к снижению способности МСК к индуцированной остеодифференцировке, что выражалось в уменьшении продукции минерализованного матрикса. В то же время при разделении сокультивируемых клеток полупроницаемой мембраной МНК не оказывали подобного эффекта. При пониженной концентрации О2 объм минерализованного матрикса, продуцируемого МСК при индукции остеодифференцировки, был в 1,5-2 раза меньше, чем при атмосферном содержании О2 (Рисунок 3.21).

Рисунок 3.21.

Содержание минерализованного матрикса после 3 недель индукции остеодифференцировки в МСК. МСК предварительно сокультивировали в течение 72 ч с ФГА-МНК, контроль – МСК в монокультуре.

Данные представлены как M±m, n=3 # - достоверное отличие от МСК в монокультуре (p0,01) * - достоверное отличие от 20% О2 (p0,01) Анализ транскрипционной активности в МСК после взаимодействия с ФГА-МНК не выявил изменений экспрессии основных маркрных генов остеогенной дифференцировки ALP (щелочная фосфатаза), RUNX2 (транскрипционный фактор остеобластической дифференцировки - Runt-связанный транскрипционный фактор) и OCN (остеокальцин), что подтвердило отсутствие значимого влияния паракринного взаимодействия с ФГА-МНК на остеогенную дифференцировку. Однако наблюдалось изменение небольшого количества генов, имеющих отношение к реализации остеогенного потенциала МСК и участвующих в развитии скелета (GO:0001501) (Рисунок 3.22). При обеих концентрациях кислорода повышалась экспрессия ALPL (тканенеспецифическая щелочная фосфатаза), продукт которого участвует в оссификации (GO:0001503), в то же время экспрессия также задействованного в этом процессе MGP (матриксный gla белок, участвует в организации кости) при 5% О2 снижалась. Происходило разнонаправленное изменение экспрессии генов, продукты которых имеют структурное значение (COL10A1, COL12A1, LTBP3, COMP), а при 5% О2 повышалась экспрессия гена TWSG1, модулирующего BMP-сигналинг.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«ПРОТОКОЛ заседания Совета директоров г. Москва Дата проведения заседания 31.05.2011 № 43 Дата составления протокола 03.06.2011 Решения Совета директоров ОАО "ИНТЕР РАО ЕЭС" приняты голосованием опросным путем. В заседании Совета директоров ОАО...»

«НОВОЖИЛОВА Елена Олеговна СОЦИАЛЬНО-ИСТОРИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС: ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ (социально-историческая экология) Специальность 22.00.01 – теория, методология и история социологии Диссертация на соискание ученой степени доктора социологических наук Научный консультант – доктор философских наук, профессор П.И. Смирнов Санкт-Петербург СОДЕРЖА...»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2016, Том 25, Экспресс-выпуск 1381: 4945-4952 Обыкновенный соловей Luscinia luscinia на северо-востоке Украины (Сумская область) Н.П.Кныш Николай Петрович Кныш. Гетманский национальный природный парк, ул. Мира, д. 6, г. Тростянец, Сумская область, 42600, Укра...»

«Введение В основу настоящей Программы положена дисциплина "Паразитология и инвазионные болезни" с разделами: общая паразитология, протозоология, гельминтология и арахноэнтомология. Программа предназначения для вступительных экз...»

«БИОЛОГИЯ Р.И. Берсимбай, А.Ю. Акпарова, Т.Е. Ещжанов, М.Т. Абишев 1 Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTМ1, GSTР1 у больных бронхиальной астмой ( Евразийский национальный университет им. Л.Н...»

«32 МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ УДК 614.2;616-036.865(574.54) ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ПЕРВИЧНОЙ ИНВАЛИДНОСТИ ВЗРОСЛОГО НАСЕЛЕНИЯ ПРИАРАЛЬЯ Н.К. Дюсембаева, Б.М. Салимбаева, Д.Х. Рыбалкина, Г.М. Салтыкова РГКП "Национальный центр гигиены труда и профессиональных заболеваний" МЗ и СР РК, г. Караганда В статье даны показатели первич...»

«Вагапов Алексей Владимирович СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 4-ГИДРОКСИ-4-МЕТИЛ-2-ОКСОФЕНИЛЦИКЛОГЕКСАН-1-КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ Специальность 14.04.02 фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь 2013 Диссертационная работ...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. 2014. – Т. 23, № 2. – С. 191-200. 595.1: 597/599 ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ И ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ГЕЛЬМИНТОВ ПОЗВОНОЧНЫХ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ © 2014 А.А. Кириллов, Н.Ю. Кириллова, И. В. Чихляев Институт экологии...»

«"Экологические проблемы малых рек, составляющих водосбор бассейна озера Байкал на примере реки Кабанья". Рецензия Проблема сохранения малых рек заслуживает большого внимания. Наша местность находится в первой водоохраной зоне оз. Байкала, поэтому тема очень актуаль...»

«Аннотация к рабочей программе дисциплины "Экология" Цели и задачи дисциплины Целью сформировать у будущих специалистов системное знание о роли экологии в когорте наук о природе; о структуре биосферы и роли в ней человека; об антропогенных воздействиях на биосферу и...»

«Программа научно-исследовательской ФТПУ 7.1-21/01 преддипломной практики УТВЕРЖДЕНА Директором ИГНД НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ПРЕДДИПЛОМНАЯ ПРАКТИКА Программа для направления 130100 "Геология и разведка полезных ископаемых", магистерская программа 130100.27 "Геология, п...»

«ЗАГАЛЬНІ ПРОБЛЕМИ УДК [577.23+615.95]574.64 В.В. Г Р У Б И Н К О Тернопольский национальный педагогический университет им. Владимира Гнатюка ул. М. Кривоноса, 2, Тернополь, 46027, Украина СИСТЕМНЫЙ ПОДХОД В ФИЗИОЛОГО-БИ...»

«Химия растительного сырья. 2000. №2. С. 5–15. УДК 662.71+504 ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ДРЕВЕСНЫХ АКТИВИРОВАННЫХ УГЛЕЙ В ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ © Е.Ю. Беляев Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира...»

«В.Л. Макаров, А.Р. Бахтизин, Е.Д. Сушко ЦЭМИ РАН Создание компьютерной модели, имитирующей внутреннюю структуру и правила функционирования региона как сложной социо-экологоэкономической системы для апробации разли...»

«РАЗДЕЛ 2. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ИСКУССТВЕННОГО РЫБОРАЗВЕДЕНИЯ 2.1. Теория экологических групп рыб и ее значение для рыбоводства Теория экологических групп рыб является обобщающей в экологической эмбриологии рыб и важна для искусственного рыборазведения. Теория была создана С.Г. Крыжан...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ АЛЕКСЕЯ ИВАНОВИЧА КУРЕНЦОВА A. I. Kurentsov's Annual Memorial Meetings _ 2011 вып. XXII УДК 595.773.4 (571.6) ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИИ КАЛЛИФОРИД (DIPTERA: CALLIPHORIDAE) ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА РОССИИ С...»

«ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРОГРАММА ХХIV ИТОГОВОЙ НАУЧНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ СТУДЕНТОВ СТАВРОПОЛЬСКОГО ГОСУДАРСТ...»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2015, Том 24, Экспресс-выпуск 1124: 1085-1104 Птицы парков Череповца Д.В.Кулаков Дмитрий Владимирович Кулаков. Санкт-Петербургское отделение Института геоэкологии им. Е.М.Сергеева...»

«Аннотация проекта (ПНИЭР), выполняемого в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014 – 2020 годы" Номер соглашения о предоставлении субсидии (государственного контракта) 14.607.21...»

«ВВЕДЕНИЕ В основу программы вступительного экзамена в аспирантуру по специальности 03.02.08 – "Экология" положены вузовские дисциплины: экология, общая биология, эволюционная теория, ботаника, зоология, физиология растений; физиология животных и пр. Она представляет собой несколько переработанный ва...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, XVIII, 6, 19 84 ИЗ ИСТОРИИ ПАРАЗИТОЛОГИИ УДК 576.89 ИЗ ИСТОРИИ ПАРАЗИТОЛОГИИ В ЛЕНИНГРАДЕ Д. А. Александров Новые направления в науке и большие цельные научные школы, разрабатывающие эти направления, обычно складываются в высших учебных заведениях — там, где Учитель непосредственно работает с Учеником, где сама организация...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, 47, 2, 2014 КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ УДК 576.895.1 ЗАРАЖЕНИЕ ГЕЛЬМИНТАМИ СИБИРСКОЙ ЛЯГУШКИ (RANA AMURENSIS BOULENGER, 1886) НА ЗАПАДНОЙ ГРАНИЦЕ АРЕАЛА © О. Н. Жигилева,* И. Ю. Кирина Тюменский государственный университет...»

«ОТЗЫВ официального оппонента на диссертацию Никаноровой Александры Дмитриевны на тему: Ландшафтно-геоэкологическое обоснование оптимизации водопользования в орошаемом земледелии Ферганской долины по специальности 25.00.36 – Геоэкология (На...»

«ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ НАИМЕНОВАНИЕ: Биологически активная добавка (БАД) к пище "БИммунал-9" ТОРГОВОЕ НАЗВАНИЕ: БИммунал 9®, BIMMUNAL 9® СТ 30273 – 1910 –ТОО 01 – 2007 Регистрационное удостоверение ТС: № KZ.16.01.78.003.E.013068.06.11 от 20.06.2011года. Экспертное заключение Экспертного совета по регистрации БАД к пи...»

«Приложение к приказу ГОУ ДО ТО "ОЭБЦУ" от 16 января 2017 года № 15 ПОЛОЖЕНИЕ о проведении областной экологической акции "Помоги птицам зимой"1. Общие положения 1.1. Областная экологическая акция "Помоги птицам зимой " (далее – Ак...»

«RU 2 438 653 C1 (19) (11) (13) РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (51) МПК A61K 9/08 (2006.01) A61K 47/30 (2006.01) A61K 9/107 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ На основании п...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Средняя общеобразовательная школа села Костромское" Муниципального образования "Холмский городской округ" Сахалинской области РАБОЧАЯ ПРОГРАММА по биологии Уровень образования (класс): 6-9 класс Количество часов: 68 часов Учитель: Чистяков Александр Анатольевич с.Костромское 2015г. Рабочая п...»








 
2017 www.net.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.